老年性癡呆病變前期TAU基因的mRNA水平原位雜交篩查試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，更具體地說，是涉及與老年性癡呆（AD)病變前期mRNA 表達(dá)改變（病理演變過程）的相關(guān)檢測技術(shù)。
【背景技術(shù)】
[0002] 阿爾茨海默?。ˋlzheimer' s disease-, AD)是最常見的癡呆類型，占所有癡呆 的609T80%，也是致殘率高和負(fù)擔(dān)大的疾病之一。到2006年，人類第一殺手心臟病死亡率 比2000年下降了 11. 5%，第二殺手卒中死亡率下降了 18. 1%，但阿爾茨海默病的死亡率卻上 升了 47. 1%，成為老年人的第5位致死原因。隨著全球性人口規(guī)模和預(yù)期壽命的增加，阿爾 茨海默病已成為世界衛(wèi)生問題，根據(jù)未來的預(yù)測，癡呆患病率每二十年增加近一倍，至2030 年將達(dá)到6570萬，到2050年將達(dá)到1億1540萬。各國阿爾茨海默病患者數(shù)增加不是均衡 的。發(fā)達(dá)國家的癡呆人數(shù)預(yù)測以100%的比例增長，而中國/印度及其南亞和西太平洋鄰國 等發(fā)展中國家將以超過300%的比例增長，中國的AD人數(shù)則將以336%的比例增長。中國是 世界上人口老化基數(shù)最大國家，截止2008年底，我國60歲以上老年人口已接近1. 69億，占 總?cè)丝诘?2%。根據(jù)2005年北京協(xié)和醫(yī)院領(lǐng)導(dǎo)的一項跨省市(北京/上海/成都/西安)流 行病學(xué)調(diào)查結(jié)果估計，65歲以上老年人AD患病率為4.8%，且隨著年齡增長而增加。因此， 中國絕不是一個AD低發(fā)國家，恰恰相反，而是世界上AD人數(shù)最多且增長速度最快的國家。 因此迅猛增加的疾病負(fù)擔(dān)必將對我國的社會經(jīng)濟(jì)發(fā)展和家庭生活產(chǎn)生重要影響。
[0003]AD是世界上致殘率高且負(fù)擔(dān)重的疾病。按照2003年度世界衛(wèi)生組織報導(dǎo)的關(guān)于 全球疾病負(fù)擔(dān)的估計，60歲以上老年人中癡呆導(dǎo)致殘疾的占11. 2%，遠(yuǎn)高于卒中（9. 5%)、骨 骼肌障礙（8. 9%)、心血管?。?%)及各種類型的癌癥（2. 4%)。據(jù)美國一個跨學(xué)科專家組的共 識估計，除脊髓損傷和晚期癌癥以外，AD致殘加權(quán)顯著高于任何其他健康狀況。在美國，AD 人口已超過500萬，AD的花費(fèi)已超過1000億美元，估計到2050年AD患者人數(shù)將以幾何級 數(shù)方式增長到1300萬人，經(jīng)過核算，每年將花費(fèi)1400億美元。AD已成為重大的公共衛(wèi)生 問題，并確定為未來幾年公共衛(wèi)生問題的研究重點(diǎn)。
[0004]AD是一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性認(rèn)知功能減退，典型 病理改變?yōu)槔夏臧撸╯enileplaque,SP)、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（neurona1fibrillary tangles,NFT)及神經(jīng)元丟失，另外伴有顆粒空泡變性（granulovacuolar degeneration,⑶)，平野小體和腦血管的改變。經(jīng)過數(shù)十年有關(guān)AD的病因和發(fā)病機(jī)制的 研究后，雖然對AD的病因還有許多不了解，但是對其病理和生理機(jī)制有了肯定和全面的認(rèn) 識，并從中發(fā)現(xiàn)了一些重要的疾病標(biāo)志?，F(xiàn)代分子遺傳學(xué)在幫助人類認(rèn)識AD的發(fā)病機(jī)制 方面意義非凡，發(fā)現(xiàn)常染色體突變能導(dǎo)致A0 42肽的表達(dá)增多，參與的基因包括TAU基因。 AD的生物標(biāo)志物能很好地幫助臨床診斷，與病理發(fā)現(xiàn)有良好的一致性。2010年美國國立老 化研究院和阿爾茨海默病聯(lián)合會推薦新的診斷定義與標(biāo)準(zhǔn)，強(qiáng)調(diào)將記憶損害與生物標(biāo)志物 結(jié)合。AD是疾病的整個臨床過程，包括了AD癡呆前期和癡呆期AD。AD的臨床前驅(qū)期則指 出現(xiàn)早期病理生理學(xué)改變至出現(xiàn)最早的認(rèn)知癥狀之間漫長的階段。當(dāng)前，臨床使用的AD治 療藥物不少，但均缺乏有臨床意義的療效。癡呆是嚴(yán)重的認(rèn)知功能損害，呈進(jìn)展性和不可逆 性，要通過藥物干預(yù)實(shí)現(xiàn)病情穩(wěn)定或緩解是極其困難的。因此，對癡呆實(shí)施預(yù)防應(yīng)該是一個 重要的臨床研究方向。最新AD研究報告表明，作為"嬰兒"這一代，到2050年在美國將有 1千3百50萬人成為AD癡呆患者。如果，假設(shè)有一種干預(yù)可以是AD癡呆的發(fā)病延遲5-10 年或提早5-10預(yù)測和篩查，那么AD癡呆患者人數(shù)將減少80%，用于AD的預(yù)計醫(yī)療費(fèi)用將 會大大減少。中國現(xiàn)有AD患者以超過800多萬，而且，發(fā)病人數(shù)每年在上升。因此，尋找有 效AD篩查工具，對臨床前期AD患者及未發(fā)生AD高危人群的早期篩查，在人群中盡早開展 干預(yù)治療，減少AD的最終發(fā)生率有重要的臨床和時代意義。盡早開發(fā)出應(yīng)用于AD病變前 期mRNA水平篩查試劑盒，這將改變目前臨床上的AD發(fā)生后的診治模式，將AD的診治提高、 提前到病變前期，做到預(yù)防性（治未病）的早期介入和治療，并進(jìn)一步做到mRNA水平的調(diào)控 及基因早期治療，將AD消滅在萌芽狀態(tài)。
[0005] 本發(fā)明人在長期研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致老年性癡呆治療效果不佳的主要原因是不能做 到真正的早期診斷和早期治療。本課題擬采用核酸原位雜交技術(shù)，尋找與AD發(fā)病密切相關(guān) 的TAU基因一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物-mRNA，觀察其在AD病人、高危人群、正常對照人群表達(dá)變化， 統(tǒng)計分析其臨床應(yīng)用意義和價值，并培養(yǎng)、開發(fā)出可應(yīng)用于臨床的早期篩查試劑盒，用于臨 床前期AD患者及高危人群的早期篩查，做到預(yù)防性診治，盡早開展干預(yù)治療，減少AD的最 終發(fā)生率。
[0006] 隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，疾病基因組學(xué)等研究的深入展開，為 了尋求更早期的篩查和治療老年性癡呆、以及預(yù)防老年性癡呆，已取得長足進(jìn)步。至今，我 們已有可能在基因的一級轉(zhuǎn)錄功能產(chǎn)物（mRNA水平)上做更精確的早期篩查和診斷，在老年 性癡呆癥的基因生理病理學(xué)演變前期，就可以做到早期預(yù)測和篩查。本發(fā)明采用核酸原位 雜交技術(shù)，選擇多組臨床標(biāo)本(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照)，對TAU基因與老年性 癡呆癥的早期預(yù)警進(jìn)行檢測分析。
[0007] TAU基因的mRNA作為早期篩查老年性癡呆病變前期有非常重要的臨床診斷意義。 TAU基因的mRNA在老年性癡呆癥前期及病變過程中表達(dá)過度。它作于老年性癡呆病變前 期篩查、及老年性癡呆癥早期預(yù)防的檢測指標(biāo)及治療后的復(fù)發(fā)預(yù)警也有非常重要的臨床意 義。
[0008] 發(fā)明人在長期的研究中，得出了一種新理念，臨床的重大疾病的臨床診治模式一 定要改變，不能只停留現(xiàn)在治已?。òl(fā)病后診治)，要做到預(yù)防性診治，做到治已病，只有這 樣才能降低重大疾病的發(fā)病率和死亡率，降低社會成本和醫(yī)療成本。因此，發(fā)明人在開發(fā)和 生產(chǎn)重大疾病的mRNA水平篩查試劑盒及治療藥物中，在理論和技術(shù)上都做了大膽創(chuàng)新。特 別是篩選臨床標(biāo)本(正常人群、高危人群、疾病患者)，突破了正常組織與疾病組織比較的一 貫性研發(fā)思路，來尋找和開發(fā)病變期前mRNA水平，與疾病早期基因病理生理學(xué)演變密切相 關(guān)，而且臨床意義非常重要靶標(biāo)，將臨床上疾病形成后診治模式變成疾病的預(yù)防性診治，爭 取了疾病診治的時間和空間，達(dá)到預(yù)防重大疾病。
[0009] 根據(jù)現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料TAU基因mRNA水平的檢測技術(shù)及試劑盒未見報道。
[0010] 本發(fā)明人在對(老年性癡呆患者、高危人群、正常對照人）例組，用原位雜交技術(shù) 進(jìn)行檢測，結(jié)果表明以上老年性癡呆癥TAU基因都過度表達(dá)，高危人群有不同程度表達(dá) 15-25%，正常人都是零表達(dá)。表明TAU基因是老年性癡呆病變前期篩查的重要標(biāo)志物。
[0011] 原位雜交技術(shù)（insituhybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈（即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補(bǔ)核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。
[0012] 原位雜交的探針是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（雖不明確 該分子全部序列，但已知其針對何靶分子)，探針的種類按核酸性質(zhì)不同又可分為DNA探針、 cDNA探針、cRNA探針和合成寡核苷酸探針。為了便于示蹤，探針必須用一定的手段加以標(biāo) 記，以利于以后的檢測。常用的標(biāo)記物包括放射性核素和非放射性標(biāo)記物兩大類。常用的 同位素標(biāo)記物有 3H、35S、125I和32P。同位素標(biāo)記物雖然有靈敏性高、背底較為清晰等優(yōu)點(diǎn)，但 是由于放射性同位素對人和環(huán)境均會造成傷害，近來有被非同位素取代的趨勢。非同位素 標(biāo)記物中目前最常用的有生物素、地高辛和熒光素三種。檢測這些標(biāo)記物的方法都是極其 靈敏的。
[0013] 根據(jù)所用探針及所要檢測核酸的不同又可分為DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA雜交。 但不論哪一種形式的雜交，都必須經(jīng)過五大過程，即組織細(xì)胞的固定，預(yù)雜交、雜交、沖洗和 顯示。本發(fā)明采用RNA-RNA的雜交方式，合成的探針（mRNA)和檢測的靶mRNA是采用堿基 互補(bǔ)（雜交互補(bǔ)）的原理，同時經(jīng)過長時間研究和觀察，啟動和中止處得殘基對檢測的結(jié)果 沒有影響（因?yàn)?，發(fā)明人采用的mRNA序列都超過450bp以上，而對于較長的堿基序列，超過 lOOObp以上，我們會選擇該基因的⑶S來做探針，如果⑶S的堿基序列長度也超過lOOObp 以上，我們會選擇其中一段堿基序列來合成探針，但要經(jīng)過Blast分析機(jī)體中是否有相同 堿基序列片段存在)。
[0014] 本發(fā)明的初衷是想改變目前臨床上重大疾病的診治模式，從