治已病變成預(yù)防性治 未病,達(dá)到預(yù)防性診治,將目前影像醫(yī)學(xué)手段和眾多生化標(biāo)記物無法檢測(cè)到老年性癡呆病 理演變前期mRNA水平量化改變技術(shù),做了創(chuàng)新性的技術(shù)突破,提供老年性癡呆前變mRNA水 平篩查技術(shù)。使臨床上有了一項(xiàng)新的老年性癡呆病理演變前期mRNA水平真正早期篩查的 技術(shù),為臨床老年性癡呆癥的早期預(yù)防和治療爭(zhēng)取時(shí)間和空間。
[0015] 綜上所述,本發(fā)明的目的首先是提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,其包含原位雜交 檢測(cè)探針和標(biāo)記物。
[0016] 其次,本發(fā)明還要提供上述試劑盒用于與老年性癡呆病理演變前期的TAU基因的 原位雜交檢測(cè)方法。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0017] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的,本發(fā)明的技術(shù)方案如下: 本發(fā)明首先提供一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,其包括雜交探針和標(biāo)記物,其中,所述的 雜交探針序列雜交探針序列如SEQIDNO. 1所示,是TAU基因⑶S中(323…2599bp),從 1021…1500bp的一段,探針長(zhǎng)480bp,與體內(nèi)的靶片段進(jìn)行反向互補(bǔ)雜交)。TAU基因序列 如SEQIDN0. 2所示,全長(zhǎng)6762bp,位于染色體17q21. 1"上。
[0018] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是,所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光或顯 色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
[0019] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括雜交液。
[0020] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括增強(qiáng)劑。
[0021] 本發(fā)明試劑盒的一個(gè)優(yōu)選方案是還包括顯色劑。
[0022] 本發(fā)明的老年性癡呆病理演變前期基因篩查試劑盒應(yīng)用價(jià)值在于,能在mRNA 水平,及早對(duì)老年性癡呆病理演變前期的篩查及老年性癡呆癥經(jīng)治療后療效的評(píng)判。 TAU基因是一種老年性早衰基因,它的表達(dá)變化表明老年性癡呆癥前期病理演變的可能,提 示臨床醫(yī)生及早介入預(yù)防和治療。
[0023] 本發(fā)明還提供一種TAU基因原位雜交的檢測(cè)方法,包括以下步驟: (1) 在上面所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下,將底物中待測(cè) RNA與雜交探針接觸,形成雜交復(fù)合體;和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
[0024] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中優(yōu)選地是,所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件為: 核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16-24小時(shí)。
[0025] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中優(yōu)選地是,所述的底物選用人的血液白細(xì)胞標(biāo)本或 其它器官組織細(xì)胞、或腦脊液標(biāo)本。更優(yōu)選地是,所述的血液標(biāo)本或其它器官組織細(xì)胞標(biāo)本 來自老年性癡呆患者、高危人群,正常人群。
[0026] 本發(fā)明所述的檢測(cè)方法,其中優(yōu)選地是,所述的高危人群、老年性癡呆癥好發(fā)家 族、經(jīng)治療后老年性癡呆癥病人。
[0027] 本發(fā)明的檢測(cè)試劑盒是采用核酸雜交技術(shù)和組化免疫方法相結(jié)合,以TAU基因?yàn)?檢測(cè)對(duì)象,合成探針是TAU基因的RNA序列,檢測(cè)的底物是人體血液標(biāo)本白細(xì)胞或組織細(xì)胞 及腦脊液的RNA的表達(dá)量。原位雜交技術(shù)的顯示方法能提供TAU基因的半定量或定量表達(dá) 程度判定。根據(jù)雜交后免疫組化顯色判定以上基因的表達(dá)量,正常人TAU基因表達(dá)低或不 表達(dá),即不顯色,TAU基因在老年性癡呆病人和正常人有顯著差異,該基因的表達(dá)量比正常 人表達(dá)量都高,高度顯色。
[0028] 本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針,雜交液,顯色劑,增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知,具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報(bào)告,其中雜交的具體步驟包括: 1) .將待測(cè)標(biāo)本放入反應(yīng)槽中; 2) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)加消化液; 3) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)后固定; 4) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)預(yù)雜交(42°C); 5) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)清洗; 6) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)雜交(42°C); 7) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)清洗; 8) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)與DIG抗體培養(yǎng)(室溫); 9) .儀器自動(dòng)棄去液體,自動(dòng)清洗,顯色; 10) .取出封片鏡檢。
[0029] 本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施例的方案是:以TAU基因?yàn)槟康幕蚝铣傻暮怂崽结樣玫?高辛標(biāo)記(地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針,不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點(diǎn),還 克服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點(diǎn)),將該雜交 探針與人體血液白細(xì)胞的待測(cè)RNA核酸進(jìn)行雜交,再用免疫組化的方法顯色,在光鏡下觀 察mRNA的存在和定位,根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù),判斷目的基因的表達(dá)量。
[0030]本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù),該方法通過檢測(cè)底物細(xì)胞中的TAU基因表達(dá)量,用來確定老年性癡呆病理演變是否已發(fā)生,因?yàn)門AU基因在正常人中低表達(dá) 或不表達(dá),如果TAU基因表達(dá)高度,說明老年性癡呆發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)非常高,以及治療后病人治療 效果評(píng)判,從而獲得老年性癡呆前期的篩查和診斷信息,幫助臨床醫(yī)生及早介入。一個(gè)試劑 盒可以多人份使用或一人份使用。
[0031]如上所述,當(dāng)檢測(cè)到TAU基因的表達(dá)高于正常對(duì)照時(shí),則可預(yù)測(cè)受試者老年性癡 呆病理演變已發(fā)生。
[0032]本發(fā)明具有如下有益效果: 本發(fā)明的臨床意義是更早期跟蹤檢測(cè)老年性癡呆病變發(fā)生和病理演變過程中老年性 癡呆癥的發(fā)生、發(fā)展趨勢(shì)。本發(fā)明可以在基因水平上檢測(cè)TAU基因異常表達(dá),亦未形成老年 性癡呆之前,能及早做到以上基因表達(dá)異常的信息采集,給臨床老年性癡呆病理演變前期 高風(fēng)險(xiǎn)人群,一個(gè)真正的早期篩查以及治療后療效判定。這樣才有可能實(shí)施老年性癡呆的 早期篩查、早期預(yù)防、早期治療,有可能從源頭上徹底根治老年性癡呆這一惡疾。
[0033]此外,本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn),同時(shí),本發(fā)明的檢測(cè) 方法操作方便、簡(jiǎn)單,能在區(qū)級(jí)以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
【附圖說明】
[0034] 圖1是本發(fā)明TAU基因原位雜交實(shí)施流程圖; 圖2是本發(fā)明實(shí)施例老年性癡呆病人TAU過量表達(dá)圖片 圖3是本發(fā)明實(shí)施例中正常人TAU表達(dá)圖片; 圖4是本發(fā)明實(shí)施例中高危人群TAU表達(dá)圖片。
【具體實(shí)施方式】
[0035]下面結(jié)合實(shí)施例,更具體地說明本發(fā)明的內(nèi)容。應(yīng)該理解,下面的實(shí)施例用于說明 而非限定本
【發(fā)明內(nèi)容】
,任何形式上的改變或變通將落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0036] 實(shí)施例1 按照常規(guī)方法制備本實(shí)施例的原位雜交試劑盒,該試劑盒包括以TAU基因?yàn)闄z測(cè)目的 基因設(shè)計(jì)的雜交探針、標(biāo)記物、說明書,其中: 本實(shí)施例的探針標(biāo)記物選用地高辛。
[0037]試劑盒雜交液組成:
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,包括雜交探針和標(biāo)記物,其特征在于,所述的雜交探針序 列如SEQIDNO. 1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,所述的標(biāo)記物選自放射性物質(zhì)、化學(xué)發(fā)光 或顯色物質(zhì)、生物素、金屬鱟、熒光素、酶及納米材料。
3. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括雜交液。
4. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括增效劑。
5. 如權(quán)利要求1所述的試劑盒,其特征在于,該試劑盒還包括顯色劑。
6. -種TAU基因原位雜交檢測(cè)方法,其特征在于,該方法包括以下步驟: (1) 在權(quán)利要求1所述的雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下,將底物 中待測(cè)RNA與雜交探針接觸,形成雜交復(fù)合體;和 (2) 檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。
7. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法,其特征在于,所述的可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件 為:核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時(shí)間為16 - 24小時(shí)。
8. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法,其特征在于,所述的底物選用人的血液白細(xì)胞和腦 脊液細(xì)胞標(biāo)本。
9. 如權(quán)利要求6所述的檢測(cè)方法,其特征在于,所述的標(biāo)本是老年性癡呆患者、高危人 群、正常對(duì)照人群。 10. TAU基因在制備檢測(cè)老年性癡呆病變前期原位雜交試劑盒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開一種原位雜交檢測(cè)試劑盒,包括雜交探針和標(biāo)記物。還公開使用本試劑盒原位雜交檢測(cè)與老年性癡呆(Alzheimer’sDisease-AD)前期病理演變有密切相關(guān)的TAU基因mRNA的方法,包括以下步驟:(1)在雜交探針與靶序列可形成穩(wěn)定雜交復(fù)合體的條件下,將底物中待測(cè)RNA與雜交探針接觸,形成雜交復(fù)合體;和(2)檢測(cè)所述雜交復(fù)合體。本發(fā)明的試劑盒和檢測(cè)方法可以在,mRNA水平上檢測(cè)TAU基因的表達(dá)功能,比現(xiàn)有的臨床生化檢測(cè)指標(biāo)和影像醫(yī)學(xué)檢查更早期,能實(shí)現(xiàn)真正的老年性癡呆(AD)病變前期mRNA水平的篩查,做到預(yù)防性診治的目的。同時(shí),本發(fā)明的檢測(cè)方法簡(jiǎn)單方便,成本低,便于醫(yī)院推廣應(yīng)用。
【IPC分類】C12Q1-68
【公開號(hào)】CN104711324
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201310669552
【發(fā)明人】張玉麗, 裘建英, 張?jiān)聘? 裘霖
【申請(qǐng)人】芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司
【公開日】2015年6月17日
【申請(qǐng)日】2013年12月11日