一種克氏原螯蝦ssr引物的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種克氏原螯蝦SSR引物的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 克氏原螯奸（Procambarus clarkii)隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門（Arthropoda)，甲殼綱 (Crustacea)，十足目（Orgerdecapoda)，爬行亞目（Reptantia)，整 ife下科（Cambaridae)，原 螯蟲下屬（Procambarus)?？耸显樵a(chǎn)于墨西哥東北部和美國(guó)中南部，由于人類和環(huán)境因 素的影響，擴(kuò)散至美國(guó)至少15個(gè)州；1918年作為牛蛙餌料引入日本，并在日本大面積繁衍 和擴(kuò)散；1929年由日本傳入我國(guó)，目前在我國(guó)21個(gè)省、市、自治區(qū)均有分布，并在一些湖泊 和溝渠成為優(yōu)勢(shì)種群。目前，克氏原螯蝦的遺傳多樣性多集中在用RAPD、線粒體細(xì)胞色素 I (COI)和微衛(wèi)星等分子技術(shù)進(jìn)行研究，其結(jié)果仍存在部分需要完善之處，因此，高效、全面、 穩(wěn)定的SSR技術(shù)的應(yīng)用對(duì)克氏原螯蝦遺傳多樣性的揭示具有很好的補(bǔ)充意義，以期為克氏 原螯蝦遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)及可持續(xù)利用提供一定的理論依據(jù)。
[0003] 微衛(wèi)星標(biāo)記，亦稱簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats, SSR)，微衛(wèi)星DNA分 子標(biāo)記在各種生物體內(nèi)廣泛分布，它具有數(shù)量大、多態(tài)信息含量高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、 檢測(cè)快速方便等特點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于對(duì)動(dòng)、植物的基因定位、連鎖分析、血緣關(guān)系鑒 定、遺傳多樣性評(píng)估、系統(tǒng)發(fā)生樹構(gòu)建、標(biāo)記輔助選擇、群體進(jìn)化研究和品質(zhì)鑒定等方面探 討?？耸显r的微衛(wèi)星分離在國(guó)內(nèi)外還未見報(bào)道。
[0004] SSR在基因組中分布廣泛，密度很高，在生物基因組中發(fā)揮著不同功能。另外SSR 與其它遺傳標(biāo)記相比較，具有位點(diǎn)眾多，多態(tài)性程度高，檢測(cè)時(shí)對(duì)DNA模板要求程度低， 檢測(cè)簡(jiǎn)單快速，是一個(gè)良好的遺傳標(biāo)記。SSR缺點(diǎn)是對(duì)于未知DNA序列的生物，SSR基因 位點(diǎn)開發(fā)較繁瑣，成本較高。對(duì)于絕大多數(shù)非模式生物或非經(jīng)濟(jì)類作物，SSR相關(guān)資料很 少，因此開發(fā)這些生物的SSR位點(diǎn)，對(duì)于生態(tài)監(jiān)控和系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究尤為重要，也可以為 以后相關(guān)研究提供良好的基礎(chǔ)。SSR標(biāo)記雖然效果好，可靠性高，但其關(guān)鍵點(diǎn)又在于SSR引 物的開發(fā)。只有在有一定數(shù)量的SSR引物之后，才可能對(duì)某一物種進(jìn)行SSR標(biāo)記的分析。 特別是對(duì)于沒有測(cè)序過的生物物種，對(duì)于其DNA堿基序列知之甚少或一無所知的物種只能 利用一些特殊的方法得到這種重復(fù)序列以及其兩邊的側(cè)翼序列來設(shè)計(jì)SSR引物。目前SSR 引物的來源，概括起來有以下四種途徑：1.關(guān)文獻(xiàn)；2.近緣種的引物（例如同屬不同種） ;3.數(shù)據(jù)庫搜尋法：在GenBank等公共數(shù)據(jù)庫中搜尋SSR序列，根據(jù)側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物；4. 自己從研究對(duì)象基因組文庫中篩選SSR位點(diǎn)兩翼序列設(shè)計(jì)引物。針對(duì)那些大多數(shù)測(cè)序很少 的物種第4種方法幾乎是唯一途徑，也是最根本、有效的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種克氏原螯蝦SSR引物的制備方法，能夠簡(jiǎn)單、快速地 篩選克氏原螯蝦整個(gè)基因組中的微衛(wèi)星序列，在短時(shí)間內(nèi)能開發(fā)大量的SSR引物，為克氏 原螯蝦的種質(zhì)保護(hù)、遺傳改良提供技術(shù)手段。
[0006] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是： 一種克氏原螯蝦SSR引物的制備方法，包括以下步驟： 一、 提取克氏原螯蝦基因組DNA :從克氏原螯蝦腹部肌肉提取基因組DNA ; 二、 探針與目的片段雜交：將生物素標(biāo)記的探針與目的片段雜交獲得雜交產(chǎn)物； 三、 磁珠富集：將雜交產(chǎn)物用磁珠富集法富集得富集產(chǎn)物； 四、 陽性克隆測(cè)序并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因 DNA :富集產(chǎn)物經(jīng)擴(kuò)展后， 轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)后藍(lán)白斑法挑選陽性克隆，PCR檢驗(yàn)陽性克隆，測(cè)序， 用Chromas V2. 33軟件分析測(cè)序結(jié)果，去掉載體序列和接頭序列；用SSR Hunter軟 件對(duì)插入序列進(jìn)行分析，找出其中的微衛(wèi)星DNA區(qū)域；根據(jù)微衛(wèi)星區(qū)域的特征，對(duì)測(cè)序結(jié) 果進(jìn)行分型；用Primer Premier 5.0軟件為微衛(wèi)星序列設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，引物設(shè)計(jì)的 參數(shù)要求為：引物長(zhǎng)度為18_22bp ;產(chǎn)物長(zhǎng)度不小于80bp，不長(zhǎng)于500bp ;擴(kuò)增退火溫度在 50-63°C之間，正反引物間Tm值相差不超過3°C ;GC含量在40-60%之間； 五、 SSR引物檢測(cè)：對(duì)每個(gè)位點(diǎn)引物的有效性和多態(tài)性進(jìn)行篩選，得到有效的微衛(wèi)星 位點(diǎn)，挑選3個(gè)DNA模板對(duì)所有合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，退火溫度使用設(shè)計(jì)引物時(shí)的 50-62°C，微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L，擴(kuò)增條件為：PCR反應(yīng)為25個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán) 包括：95°C變性30s，54°C退火lmin，72°C延伸lmin，首次循環(huán)前預(yù)變性5min，最后一次循環(huán) 結(jié)束后，72°C再延伸IOmin ;擴(kuò)增產(chǎn)物按照5:1的體積比加入上樣緩沖液，95°C變性5min， 立即-20°C凍存15min，在8%的聚丙烯酰胺凝膠上電泳，100W恒功率電泳2h，用銀染法進(jìn)行 染色、顯色、定影，凝膠成像儀記錄凝膠圖像；將正常擴(kuò)增的引物對(duì)用挑選出的DNA模板在 退火溫度50-62°C下進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在聚丙烯酰胺膠上電泳的結(jié)果讀帶，選擇帶型清晰，至 少有兩個(gè)或兩個(gè)以上等位基因的引物。
[0007] 作為優(yōu)選，探針與目的片段的雜交具體包括以下步驟： ⑴克氏原螯蝦基因組DNA片段的獲得：使用i&el酶切克氏原螯蝦基因組DNA，37°C孵 育3h ; (2)酶切產(chǎn)物的回收：使用膠回收試劑盒回收酶切后產(chǎn)物中的400-1200bp片段得回 收后DNA片段； ⑶接頭的制作：將i&el接頭A和i&el接頭B兩條核苷酸鏈分別加 CldH2O溶解至50 μ mol/L ;等比例混合兩組寡核苷酸鏈，95°C變性10 min，然后自然冷卻至室溫得i&el接 頭，-20 °C保存待用； (4) 回收后DNA片段與接頭的連接：將回收后DNA片段與i&el接頭連接得連接產(chǎn)物； (5) 連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增：以連接產(chǎn)物為模板，MseI-N為引物進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，PCR反應(yīng)設(shè) 置為：72°C反應(yīng)7min以補(bǔ)齊接頭，94°C預(yù)變性4min，，94°C變性lmin，53°C退火lmin， 72°C延伸lmin，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸7min，預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物4°C保存待用； (6) 生物素探針雜交：取預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物18 μ L，KKTC水浴解鏈lOmin，加入55°C預(yù)熱的雜 交緩沖液77 μ L和生物素標(biāo)記的探針5 μ L，構(gòu)成100 μ L雜交體系，55°C水浴30min后冷卻 至室溫，加入300 μ L TENltltl緩沖液混勻獲得雜交產(chǎn)物，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0008] 作為優(yōu)選，所述 MseI 接頭 A 的序列為：5' -TACTCAGGACTCAT-3'（SEQ ID No :1); MseI 接頭 B 的序列為：5' -GACGATGAGTCCTGAG-3'（SEQ ID No :2)。
[0009] 作為優(yōu)選，所述 MseI-N 的序列為：5'-GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3'（SEQ ID No :3)。
[0010] 一種克氏原螯蝦SSR引物，所述克氏原螯蝦SSR引物為由正向引物和反向引物組 成的引物對(duì)，所述引物對(duì)選自以下之一： F : 5,-CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG-3, (SEQ ID No ：4)和 R: 5' -TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG-3' （SEQ ID No :5)、 F: 5'- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3' (SEQ ID No ：6)和 R: 5'- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3' （SEQ ID No:7)、 F: 5'- CCTCGGGTGTGGTGTTAGTG -3' (SEQ ID No ：8)和 R: 5'- TCAGGAGACAGGTTTGGTGTG -3' （SEQ ID No:9)、 F:5，-AGCCCGATAGCCTCAGGAAT-3，（SEQIDN〇:10^PR:5，-ATGAGCTTCAGCGGACAGG -3， （SEQ ID No :11)、 F: 5' - CCACCAACATCGGTCTACCC -3' (SEQ ID No ： 12)和 R: 5'- CGCTCCATGCAATGATGCTG -3' （SEQ ID No:13)。 toon] 本發(fā)明的有益效果是：采用磁珠富集法，能夠簡(jiǎn)單、快速地篩選克氏原螯蝦整個(gè)基 因組中的微衛(wèi)星序列，在短時(shí)間內(nèi)能開發(fā)大量的SSR引物，為克氏原螯蝦的種質(zhì)保護(hù)、遺傳 改良提供技術(shù)手段。
【附圖說明】
[0012] 圖1是克氏原螯蝦基因組DNA檢測(cè)電泳圖，圖1中第1-24孔(從左至 右）為克氏原螯蝦基因組DNA樣品，第25孔為Marker ;條帶大小從上到下為： 100, 250, 500, 750, 1000, 2000bp。
[0013] 圖2是微衛(wèi)星富集瓊脂糖電泳檢測(cè)圖，圖2中第1-5膠孔(從左至右)均為富集PCR 產(chǎn)物，第6膠孔為Marker ;條帶大小從上到下為：100, 250, 500, 750, 1000, 2000bp。
[0014] 圖3是菌液PCR產(chǎn)物示意圖，圖3中第1-12, 13-25膠孔(從左至 右）均為菌液為模板的PCR產(chǎn)物，第13膠孔為Marker ;條帶大小從上到下為： 100, 250, 500, 750, 1000, 2000bp。
[0015] 圖4是X39位點(diǎn)的引物擴(kuò)增的瓊脂糖檢測(cè)電泳圖，圖中，1-15孔(從左至右)為克氏 原螯蝦1-15號(hào)樣品X39引物擴(kuò)增產(chǎn)物，條帶清晰無雜帶。16孔為Marker DM2000(購(gòu)自北 京康為世紀(jì)生物科技有限公司，條帶從下到上大小分別為 2,000 bp、l，000 bp、750 bp、500 bp、250 bp 和 100 bp。
[0016] 圖5是X39測(cè)序峰圖。
[0017]
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過具體實(shí)施例，并結(jié)合附圖，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步的具體說明。
[0019] 本發(fā)明中，若非特指，所采用的原料和設(shè)備等均可從市場(chǎng)購(gòu)得或是本領(lǐng)域常用的。 下述實(shí)施例中的方法，如無特別說明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0020] 實(shí)施例： 一種克氏原螯蝦SSR引物的制備方法，包括以下步驟： 一、提取克氏原螯蝦基因組DNA STE 緩沖液：NaCl 0.1 mol/L :50 ml Jris-Cl 0.05 mol/L (ρΗ=8· 0):25 ml ;EDTA 0.05 mol/L (ρΗ=8·0):50 ml;ddH20:50 m