l;溶液 pH 調(diào)至 8.0,滅菌備用。
[0021] 剪取活著的克氏原螯蝦腹部肌肉l〇〇±l〇mg于1.5 mL離心管中，用干凈的剪刀 將組織剪碎。離心管中依次加入如下試劑：500 μ L STE緩沖液；25 μ L蛋白酶K(10mg/mL) (merck);75 yL 10% (質(zhì)量體積比）的SDS，混勻后置56°C下消化過夜。加入等體積水飽 和酚溶液，輕輕顛倒混合5min以上。7000r/min離心5min，小心將上清液移至另一干凈的 離心管中。加入等體積的苯酚：氯仿：異戊醇（25:24:1，體積比）抽提一次，12000 r/min 離心10 min。加入等體積的氯仿：異戊醇（24:1)抽提一次，12000 r/min離心10分鐘，取 上清。在上清液中加入1/10體積的3mol/L的NaAc (pH=5. 2)，2倍體積-20°C預(yù)冷的無水 乙醇沉淀DNA。-70°C下沉淀2h。12000r/min離心10min，再以70% -20°C預(yù)冷的乙醇洗滌 DNA沉淀一次，自然晾干后以200-500 μ L純水溶解DNA樣品。取1 μ L左右的樣品進(jìn)行電泳 檢測DNA質(zhì)量(見圖1)。
[0022] 二、探針與目的片段雜交： (1)克氏原螯蝦基因組片段的獲得： 使用MseI (MBI)酶切克氏原螯蝦基因組DNA，37°C孵育3h，酶切反應(yīng)50 μ L體系： 克氏原螯蝦基因組 DNA: IOOng; IOXbuffer (MseI 酶自帶）：5.0yL; MseI (10U): 1 μ L;去離子水補(bǔ)足至50 μ L。酶切完成后，L 5%的瓊脂糖檢測酶切效果，如果400-1200 bp的片段占絕對優(yōu)勢標(biāo)明酶切完畢。
[0023] (2)酶切產(chǎn)物的回收 使用膠回收試劑盒(賽百盛公司（上海)）回收酶切后產(chǎn)物中的400_1200bp片段，操作步 驟如下： 在紫外燈下，切取含400-1200bpDNA片段的瓊脂糖凝膠，每0.1 g膠加300 μ L溶膠液 (試劑盒提供）；50°C水浴lOmin，每2-3min震蕩一次，使凝膠充分溶解；將溶膠液小心滴加 于分離柱上，12000r/min離心Imin ;倒掉收集管中的液體，在分離柱中加入500 μ L漂洗緩 沖液(試劑盒提供)，放置5min，12000r/min離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液；將倒掉液體 后的分離柱和收集管(試劑盒提供)再次以12000r/min離心5min，倒掉殘余的液體，室溫放 置5分鐘；將分離柱放置于一個新的I. 5mL收集管中，分離柱中央硅膠膜上加入300 μ L洗 脫緩沖液(試劑盒提供)，60°C水浴2min，12000r/min離心2min，收集離心下來的液體。瓊 脂糖凝膠電泳檢測回收結(jié)果，使用核酸蛋白儀測定DNA濃度，稀釋至lOOng/yL (回收后基 因組DNA)。
[0024] (3)接頭的制作 將 i&el 接頭 A 和 i&el 接頭 B (MseI 接頭 A :5'-TACTCAGGACTCAT-3'（SEQ ID No :1); MseI接頭B :5' GACGATGAGTCCTGAG-3'（SEQ ID No :2);由南京金斯瑞生物有限公司合成） 兩條核苷酸鏈分別加 CldH2O溶解至50 μ mol/L;等比例混合兩組寡核苷酸鏈，95°C變性10 min，然后自然冷卻至室溫得MseI接頭，-20 °C保存待用。
[0025] (4)回收后DNA片段與接頭的連接 pGEM-T easy載體購自Promega公司。
[0026] 連接反應(yīng) 20μ L 體系：回收后基因組 DNA(100ng/y L) : 5· 0μ L; 2Xrapid ligase buffer (Promega PGEM-T easy vector 試劑盒提供）：10.0 μL; MseI 接頭 (25 μ Μ): 5.0 μ L; T4 DNA連接酶(購自Promega公司）（3U): 2.0 μ L;去離子水補(bǔ)足至 20yL。16°C連接4h，連接產(chǎn)物保存于-20°C備用。
[0027] (5)連接產(chǎn)物的預(yù)擴(kuò)增 以連接產(chǎn)物為模板，MseI-N 為引物（MseI-N: 5' -GATGAGTCCTGAGTAA(N)-3' (SEQ ID No:3)，由上海賽百盛公司合成）進(jìn)行預(yù)擴(kuò)增，20yL反應(yīng)體系：10XPCR buffer:2.0yL;dNTPs:0.5yL;MseI-N 引物（10μΜ):0·5μL;Τ4 DNA 連接酶（5U): 1. 0 μ L;稀釋10倍后的連接產(chǎn)物：2. 0 μ L;去離子水補(bǔ)足至20 μ L。
[0028] PCR反應(yīng)設(shè)置為：72°C反應(yīng)7min以補(bǔ)齊接頭，94°C預(yù)變性4min，（94°C變性lmin， 53°C退火lmin，72°C延伸lmin)反應(yīng)30個循環(huán)，最后72°C延伸7min。PCR產(chǎn)物(預(yù)擴(kuò)增產(chǎn) 物）4°C保存待用。
[0029] (6)生物素探針雜交 雜交緩沖液：20XSSC :0. 3 mL ;10% SDS :0. 01 mL ;加 ddH20,定容至 I mL。
[0030] TEN·緩沖液：Tris-Cl I mol/L :1 mL ;EDTA 0· 5 mol/L :0· 2 mL ;NaCl 5 mol/ L :2 mL ;調(diào)節(jié)pH值至7. 5,加 ddH20,定容至100 mL，滅菌待用。
[0031] 取上述預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物18yL，KKTC水浴解鏈IOmin,加入55°C預(yù)熱的雜交緩沖液 77 μ L和生物素標(biāo)記的探針5 μ L(生物素標(biāo)記（AC)8探針由上海賽百盛生物有限公司合成， (AC)8探針序列為 5' - ACACACACACACACAC -3'（SEQ ID No :14))，構(gòu)成 IOOyL 雜交體系。 55°C水浴30min后緩慢冷卻至室溫，加入300 μ L TENltltl緩沖液混勻，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0032] 三、磁珠富集 磁珠富集所用的磁珠、磁架及配套試劑均為PR0MEGA公司生產(chǎn)。
[0033] (1)將洗脫緩沖液置于70°C水浴鍋中預(yù)熱； (2) 將NEB S1420S磁珠震蕩懸浮，吸取20 μ L于一 I. 5mL的離心管中，磁力架固定磁 珠加入200 μ L TENiqq緩沖液洗滌3次，洗滌完畢后用40 μ L TEN 1QQ緩沖液重懸磁珠； (3) 將生物素雜交產(chǎn)物全部加入磁珠，室溫反應(yīng)30min; (4) 用磁力架固定磁珠，吸去雜交反應(yīng)液，TENltia^液洗滌3次，每次300 μ L ; (5) 用磁力架固定磁珠，使用4 °C預(yù)冷的TENltia^液洗滌3次，每次300 μ L; (6) 加入預(yù)熱的50 μ L洗脫緩沖液，渦旋震蕩懸浮磁珠，室溫孵育2min，70°C水浴 l〇min，用磁力架固定好離心管后，迅速吸取上清，保存?zhèn)溆茫?(7) 按1:2的比例加入10(^1^水凍乙醇，再加入1(^1^5 111〇1/1似六(3,41：，120001·/ min離心20min,棄上清后用70% (體積比）的乙醇洗漆2遍。然后4?，12000r/min離 心20分鐘，小心吸出上清，室溫下干燥5min，加入20 μ L無菌水溶解（富集產(chǎn)物，（見圖 2))，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0034] 四、陽性克隆測序并根據(jù)微衛(wèi)星側(cè)翼序列設(shè)計引物擴(kuò)增基因 DNA (1)目的DNA片段的體外連接： 使用T-A克隆技術(shù)，以Promega公司PGEM-T easy連接擴(kuò)增后的微衛(wèi)星富集產(chǎn)物片 段（步驟三獲得），IOyL 連接反應(yīng)體系：PGEM-T easy :0·5μ L ;2Xrapid ligase buffer: 5.0μL;微衛(wèi)星富集產(chǎn)物片段：1.0μL;Τ4 DNA連接酶（3υ):1.0μL;去離子水補(bǔ)足至 10 μ L。16°C連接過夜獲得連接產(chǎn)物。
[0035] (2)轉(zhuǎn)化 (A) 吸取50 μ L感受態(tài)細(xì)胞（大腸桿菌DH5 α菌株，Promega公司）于I. 5mL離心管 中，冰浴下緩慢融化； (B) 向離心管中加入連接產(chǎn)物，體積不超過感受態(tài)細(xì)胞體積的5%，輕輕混勻。將離心管 置于42°C水浴中熱擊90s,然后立即置于冰上5min。
[0036] (C)向離心管中加入600 μ L SOC培養(yǎng)基（100 ml組份濃度：2% (W/V)胰蛋白胨， 0.5% (W/V)酵母抽提物，0.05% (W/V) NaCl，2. 5 mM KCl 10 mM MgC12, 20 mM 葡萄糖。
[0037] 配制I M的葡萄糖溶液：將18 g的葡萄糖溶解在90 ml的去離子水中，定容至 100 ml，用0.22 μ m濾膜過濾除菌。向100 ml SOB培養(yǎng)基中加入除菌的I M葡萄糖溶液 2 ml，均勻混合。4°C保存)，以水浴將培養(yǎng)基加熱至37°C。恒溫振動器中37°C，200r/min轉(zhuǎn) 速，震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)lh。
[0038] (D)將200μ L細(xì)菌懸浮液加入4μ L IPTG (2g IPTG溶解在8ml蒸餾水中，用蒸餾 水定容至IOml，用0. 22 μ m濾器過濾除菌，分裝成Iml小份貯存于-20°C )和40 μ L X-GAL (X-Gal Ig(購自Amresco)溶于5mL滅菌水中，用0. 22 μ m濾膜過濾除菌，分裝后儲存 于-20°C待用）后，均勻地涂布在含有50 μ g/ml氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，待液體徹 底吸收后，于37°C條件下倒置培養(yǎng)12h。
[0039] (3)微衛(wèi)星陽性克隆的篩選及測序 (A)陽性克隆的挑取、培養(yǎng) 一般將每個平板的克隆數(shù)控制在200個左右，以方便挑選陽性克隆。將培養(yǎng)好的平板 (菌落生長良好并且分布均勻）在4°C放置若干小時，使菌落充分顯色（陽性克隆為白色，空 質(zhì)粒為藍(lán)色或淡藍(lán)色)。
[0040] 用無菌牙簽挑取白色克隆到500 μ L LB液體培養(yǎng)基(含50 μ L Amp)中，置于37°C 搖床上，220rpm轉(zhuǎn)速培養(yǎng)過夜，4°C保存菌液。
[0041] (B) PCR檢驗陽性克隆 使用載體正向測序引物 M13 (-47) (5 ' -CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3 '（ SEQ ID No :15))和（AC) 8探針進(jìn)行PCR。取IyL菌液作為PCR模板，擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μ L， 同時做陰性對照，反應(yīng)體系構(gòu)成為：菌液：1以1^1(^1的引物組3(-47):1111^1(^皿 的（AC)^#:lyL ;25mmol/]\^Mg2+:2yL;10XTaqbufTer:2.5yL ;2.5mmol/I^ dNTP :1· 2μ L ;Taq聚合酶：0· 2μ L ;ddH20 :13· 1μ L。PCR反應(yīng)為25個循環(huán)，每個循環(huán)包 括：95 °C變性30s，54 °C退火Imin，