一種用于鑒定羚羊角的引物對(duì)及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及中藥及中藥材鑒定領(lǐng)域，特別涉及一種用 于鑒定羚羊角的引物對(duì)及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 據(jù)《中國(guó)藥典》（2010)年版一部記載，羚羊角來(lái)源為牛科動(dòng)物賽加羚羊Saiga tatarica Linnaeus的角。鈴羊角是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，具有平肝息風(fēng)、清肝明目、散 血解毒的功效，用于肝風(fēng)內(nèi)動(dòng)、驚癇抽搐、妊娠子癇，癲癇發(fā)狂，頭痛眩暈等，主要分布于 我國(guó)及一些中亞國(guó)家，但是分布于我國(guó)新疆地區(qū)的賽加羚羊由于過(guò)度捕獵而滅絕，而分 布于國(guó)外的種群也因盜獵等原因在短短幾年內(nèi)數(shù)量下降了 90% (Jiang ZG，Gao ZX，Sun QY. Current status of antelopes in China. J Northeast For Univ, 1996, 7(I):58 ； Milner-Gulland EJ,Kholodova MV, Bekenov A, et al.Dramatic declines in saiga antelope populations. Oryx, 2001，35(4):340)〇
[0003] 在我國(guó)民間，山羊、綿羊、藏原羚、蒙原羚、鵝喉羚等的角可當(dāng)作賽加羚羊的代用品 使用（徐必達(dá)，張華林.羚羊角及其代用品的研宄進(jìn)展.中藥材，2003, 26(12) :910)。在 中藥市場(chǎng)上，羚羊角被制成粉末、絲條等形狀銷(xiāo)售，加上部分商販有意造假，羚羊角種類(lèi)難 以識(shí)別。為確保藥材市場(chǎng)中羚羊角的質(zhì)量及其臨床療效，需建立更加快速、準(zhǔn)確的方法來(lái)鑒 定羚羊角與其混偽品。
[0004] 不同研宄學(xué)者分別采用形態(tài)、顯微方法、薄層色譜法、蛋白電泳法等對(duì)羚羊角 進(jìn)行鑒定（翟延君，王榮祥，紀(jì)俊元.羚羊角及其偽品的生藥鑒定研宄.中國(guó)中藥雜 志，2000, 25(6) :334-337 ;趙華英，許欣榮，陳永林，等.羚羊角及其偽品的蛋白電泳鑒 另Ij.中國(guó)中藥雜志，1994, 19 (9): 524;馬新，羚羊角與綿羊角，山羊角，牛角及鹿角的薄 層色譜鑒別.中藥新藥與臨床藥理，1994, 5(1) :47)，但這些方法比較繁瑣，不利于推廣。
[0005] DNA分子標(biāo)記技術(shù)是近二十年來(lái)興起并不斷發(fā)展和完善的新檢測(cè)技術(shù)。而就DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在藥材鑒定中的應(yīng)用而言，DNA分子標(biāo)記則是從分子水平上客觀地反映待測(cè) 材料基因片段之間的差異，鑒別結(jié)果不受環(huán)境因素、樣品形態(tài)和材料來(lái)源的影響，一般通過(guò) 雜交或電泳等方式就能直觀地體現(xiàn)出來(lái)，結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。
[0006] 綜上所述，不同研宄學(xué)者分別采用蛋白電泳方法等對(duì)羚羊角藥材進(jìn)行鑒定研宄， 但這些方法測(cè)試時(shí)間較長(zhǎng)，且均需要電泳檢測(cè)才可完成，因此相比較熒光染色方法繁瑣，不 利于現(xiàn)場(chǎng)快速鑒別的應(yīng)用與推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的引物對(duì)。
[0008] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的引物對(duì)，具體為由序列表中序列1 和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對(duì)。
[0009] 所述引物對(duì)中，兩條單鏈DNA分子既可以分別單獨(dú)包裝，也可以按照摩爾比為1:1 的比例混合后包裝在一起。
[0010] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的試劑盒。
[0011] 本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的試劑盒，具體可含有所述引物對(duì)、 dNTP和DNA聚合酶。
[0012] 根據(jù)需要，所述試劑盒中還可含有熒光染料SYBR Green I。
[0013] 制備所述引物對(duì)的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014] 制備所述引物對(duì)的方法，具體可包括將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別 單獨(dú)包裝的步驟。
[0015] 制備所述試劑盒的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0016] 制備所述試劑盒的方法，具體可包括如下A)或B)的步驟：
[0017] A)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP和DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)：
[0018] B)將組成所述引物對(duì)的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的 dNTP、DNA聚合酶和SYBR Green I包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
[0019] 所述引物對(duì)，或所述試劑盒，在鑒定或輔助鑒定羚羊角中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的 保護(hù)范圍。
[0020] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)樣品中是否含有羚羊角的方法。
[0021] 本發(fā)明所提供的利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品中是否 含有羚羊角的方法，具體可包括如下步驟：
[0022] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)（序列1和序列2) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0023] (b)為如下（bl)或（b2):
[0024] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定待測(cè)樣品中是否含有 羚羊角：若PCR產(chǎn)物中含有100_500bp (如240-260bp)的DNA片段，則所述待測(cè)樣品中含有 或候選含有羚羊角；若PCR產(chǎn)物中不含有100_500bp (如240-260bp)的DNA片段，則所述待 測(cè)樣品中不含有或候選不含有羚羊角；
[0025] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，按照如下方法 確定待測(cè)樣品中是否含有羚羊角：若觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品 中含有或候選含有羚羊角；若觀察不到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品不含 有或候選不含有羚羊角。
[0026] 在所述方法中，所述羚羊角為中藥材。當(dāng)然所述方法也可以用于檢測(cè)羚羊角的基 原動(dòng)物--賽加鈴羊（Saiga tatarica Linnaeus)。相應(yīng)的，所述待測(cè)樣品既可為單一或混 合的中藥材成品，也可以為動(dòng)物。
[0027] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種利用所述引物對(duì)或所述試劑盒鑒定或輔助鑒定 待測(cè)樣品為羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種的方法。
[0028] 本發(fā)明所提供的鑒定或輔助鑒定待測(cè)樣品為羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原 羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種的方法，具體可包括如下步驟：
[0029] (a)從待測(cè)樣品中提取基因組DNA作為模板，采用所述引物對(duì)進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0030] (b)為如下（bl)或（b2):
[0031] (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測(cè)樣品為 羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種：若PCR產(chǎn)物中 含有100-500bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品為或候選為羚羊角；若PCR產(chǎn)物中不含有 100-500bp的DNA片段，則所述待測(cè)樣品為或候選為黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角 和山羊角中任一種；
[0032] (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I，按照如下方法 確定待測(cè)樣品為羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種：若 觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品為或候選為羚羊角；若觀察不到所述 反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測(cè)樣品為或候選為黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚 角和山羊角中任一種；
[0033] 所述待測(cè)樣品為羚羊角、黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一 種（既可為中藥材也可為其基原動(dòng)物）。
[0034] 在上述兩方法的步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的退火溫度可為62°C。
[0035] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)條件如下：8