8°C Imin ;88°C 5s、 62°C 10s、28 個(gè)循環(huán)。
[0036] 在上述兩方法的步驟（a)中，在進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系中，所述引物對中每 條單鏈DNA分子的終濃度均為125nM。
[0037] 在本發(fā)明中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí)采用的具體反應(yīng)體系如下：2. OyL IOXbuffer 緩沖液，1. 6 μ L濃度為2. 5mM的dNTP，0. 5 μ L濃度為5 μ M的序列1所示的引物Fl，0. 5 μ L 濃度為5 μΜ的序列2所示的引物F2,0. 2 yL SpeedStar HS Taq DNA聚合酶（Takara公司， 5U/ μ L)，0. 5 μ L模板DNA，無菌雙蒸水補(bǔ)足至20 μ L。
[0038] 在上述兩方法中，所述100-500bp (如240-260bp)的DNA片段具體為大小約為 250bp的DNA片段（在瓊脂糖凝膠電泳圖譜上與DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)位于250bp處的條帶基本 處于同一水平位置上）。
[0039] 在實(shí)際應(yīng)用中，判斷所述PCR產(chǎn)物中是否含有100-500bp (如240-260bp)的 DNA片段，可通過將所述PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，若電泳結(jié)果顯示含有 100-500bp (如240-260bp)目的條帶，則所述PCR產(chǎn)物中含有100-500bp (如240-260bp)的 DNA片段；反之，則不含有100-500bp (如240-260bp)的DNA片段。當(dāng)然也通過測序的方法 判定所述PCR產(chǎn)物中是否含有100_500bp (如240-260bp)的DNA片段。
[0040] 在上述兩方法的步驟（b2)中，向所述反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBR Green I時(shí)， 所述熒光染料SYBR Green I的加入量為：每20 μ L所述反應(yīng)體系中加入1 μ L 100 X SYBR Green I (Invitrogen公司，其產(chǎn)品目錄號為1135054)。
[0041] 在上述兩方法的步驟（b2)中，確定所述反應(yīng)體系是否產(chǎn)生綠色熒光具體是在 365nm紫外波長下進(jìn)行檢測的。
[0042] 實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法及熒光染色的方法實(shí)現(xiàn) 了羚羊角與其混偽品的快速、準(zhǔn)確鑒別，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行檢測，為 實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運(yùn)用提供技術(shù)支撐。
【附圖說明】
[0043] 圖1為羚羊角與其混偽品PCR鑒別結(jié)果。其中，泳道1為陰性對照；泳道2-6為羚 羊角；泳道7為黃羊角；泳道8為原羚角；泳道9為普氏原羚角；泳道10為鵝喉羚角；泳道 11-12為山羊角；泳道M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)：從上至下依次為2000bp、1000 bp、750bp、500bp、 250bp、100bpD
【具體實(shí)施方式】
[0044] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0045] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0046] 下述實(shí)施例中所用材料如表1所示：
[0047] 表1樣品來源表
[0048]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的引物對，其特征在于：所述引物對為由序列表中序列 1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。
2. 用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中含有權(quán)利要求1 所述的引物對、dNTP和DNA聚合酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有熒光染料SYBR Green1〇
4. 制備權(quán)利要求1所述引物對的方法，包括將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分 別單獨(dú)包裝的步驟。
5. 制備權(quán)利要求2或3所述試劑盒的方法，包括如下A)或B)的步驟： A) 將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的dNTP和 DNA聚合酶包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)： B) 將組成所述引物對的兩條單鏈DNA分子分別單獨(dú)包裝后，與分別單獨(dú)包裝的dNTP、 DNA聚合酶和SYBRGreenI包裝于同一個(gè)試劑盒內(nèi)。
6. 權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，在鑒定或輔助鑒定羚羊 角中的應(yīng)用。
7. 利用權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，鑒定或輔助鑒定待 測樣品中是否含有羚羊角的方法，包括如下步驟： (a) 從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； (b) 為如下（bl)或（b2): (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣品中是否含有 羚羊角：若PCR產(chǎn)物中含有100_500bp的DNA片段，則所述待測樣品中含有或候選含有羚羊 角；若PCR產(chǎn)物中不含有100-500bp的DNA片段，則所述待測樣品中不含有或候選不含有羚 羊角； (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，按照如下方法確定 待測樣品中是否含有羚羊角：若觀察到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品中含 有或候選含有羚羊角；若觀察不到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品不含有或 候選不含有羚羊角。
8. 利用權(quán)利要求1所述的引物對或權(quán)利要求2或3所述的試劑盒，鑒定或輔助鑒定待 測樣品為羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種的方法，包 括如下步驟： (a) 從待測樣品中提取基因組DNA作為模板，采用權(quán)利要求1所述的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò) 增； (b) 為如下（bl)或（b2): (bl)根據(jù)步驟（a)所得PCR產(chǎn)物的大小，按照如下方法確定所述待測樣品為羚羊角，還 是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種：若PCR產(chǎn)物中含有100-500bp 的DNA片段，則所述待測樣品為或候選為羚羊角；若PCR產(chǎn)物中不含有100-500bp的DNA 片段，則所述待測樣品為或候選為黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一 種； (b2)向步驟（a)擴(kuò)增后的反應(yīng)體系中加入熒光染料SYBRGreenI，按照如下方法確定 待測樣品為羚羊角，還是黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種：若觀察 到所述反應(yīng)體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品為或候選為羚羊角；若觀察不到所述反應(yīng) 體系產(chǎn)生綠色熒光，則所述待測樣品為或候選為黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和 山羊角中任一種； 所述待測樣品為羚羊角、黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角和山羊角中任一種。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于：在步驟（a)中，進(jìn)行所述PCR擴(kuò)增時(shí) 采用的退火溫度為62°C; 具體的，進(jìn)行所述？〇?擴(kuò)增時(shí)采用的擴(kuò)增程序?yàn)椋?81：11^11;881：58、621：1〇8,28個(gè)循 環(huán)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：在步驟（b2)中，確定所述反應(yīng) 體系是否產(chǎn)生綠色熒光是在365nm紫外波長下進(jìn)行檢測的。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于鑒定羚羊角的引物對及其應(yīng)用。本發(fā)明所提供的用于鑒定或輔助鑒定羚羊角的引物對，具體為由序列表中序列1和序列2所示的兩條單鏈DNA分子組成的引物對。實(shí)驗(yàn)證明，采用本發(fā)明所提供的引物，通過快速PCR方法及熒光染色的方法實(shí)現(xiàn)了羚羊角與黃羊角、原羚角、普氏原羚角、鵝喉羚角、山羊角等的快速、準(zhǔn)確鑒別，并引入了熒光染料法對真?zhèn)舞b別結(jié)果進(jìn)行檢測，為實(shí)現(xiàn)藥材分子鑒別的現(xiàn)場運(yùn)用提供技術(shù)支撐。
【IPC分類】C12N15-11, C12Q1-68
【公開號】CN104726599
【申請?zhí)枴緾N201510144799
【發(fā)明人】黃璐琦, 袁媛, 崔占虎, 蔣超, 金艷
【申請人】中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
【公開日】2015年6月24日
【申請日】2015年3月30日