用于產(chǎn)生棒麥角素型生物堿的基因和方法
【專利說明】
[0001] 本申請要求 US 61/691848、EP 12181388. 5、US 61/786841、EP13159444. 2 和 EP 13178008. 2號申請的優(yōu)先權(quán)，所述文獻均通過引用的方式完整并入。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明原則上涉及重組產(chǎn)生棒麥角素型生物堿（clavine-type alkaloids)如環(huán) 棒麥角素（cycloclavine)、狐茅麥角堿（festuclavine)、田麥角堿（agroclavine)、裸麥角 堿（chanoclavine)和裸麥角堿醛（chanoclavine aldehyde)的領(lǐng)域。本發(fā)明提供用于產(chǎn) 生棒麥角素型生物堿的微生物和方法、以及可以在產(chǎn)生棒麥角素型生物堿的方法中使用的 多肽、多核苷酸和包含這類多核苷酸的載體。
【背景技術(shù)】
[0003] 麥角類生物堿（ergot alkaloids)屬于具有多樣性結(jié)構(gòu)和生物活性的Π 引噪衍 生物復(fù)雜家族（Flieger 1997，F(xiàn)olia Microbiol (Praha) 42:3 - 30 ;Schardl2006, Chem Biol 63:45 - 86)，由以下科的真菌產(chǎn)生：麥角科（Clavicipitaceae)(例如麥角菌屬 (Claviceps)和 Neotyphodium 或香柱菌屬（Epichloee))和發(fā)菌科（Trichocomaceae) (包括曲霉屬（Aspergillus)和青霉屬（Penicillium))。重要的天然生產(chǎn)者是麥角菌 屬、青霉屬和曲霉屬真菌（Flieger 1997,見上述引文；Schradl，見上述引文），但是它 們還存在于蜜孢霉屬（Sphacelia)、瘤座菌屬（Balansia)或Periglandula中（Pai outovdi，S·等人，2008, Fungal Diversity，31:95_110 和 Steiner，U.2011，Mycolog ia，103 (5) : 1133-1145)。天然麥角類生物堿及其半合成性衍生物廣泛應(yīng)用于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中并 且顯示出廣譜藥理學(xué)活性，包括子宮收縮活性、調(diào)節(jié)血壓、控制垂體激素分泌、預(yù)防偏頭痛 和多巴胺能活性及神經(jīng)安定活性（de Grootl998，Drugs 56:523 - 535 ;Haarmann 2009, Mol Plant Pathol 10:563 - 577 ;Schardl2006,見上述引文）。麥角類生物堿可以根據(jù)它們的 結(jié)構(gòu)特征分成兩類，即，D-麥角酸的酰胺衍生物和棒麥角素型生物堿（Flieger 1997,見 上述引文；Griiger 1998，Alkaloids Chem Biol 50:171-218)。第一組的成員通常由 麥角酸和肽結(jié)構(gòu)部分組成。它們又稱作麥角肽堿（ergopeptine)。麥角肽堿的重要成員 例如是麥角胺（ergotamine)和麥角繳堿（ergovaline)。棒麥角素型生物堿，如環(huán)棒麥角 素、田麥角堿、煙曲麥角堿（fumigaclavine)和相似物質(zhì)如野麥角堿（elymoclavine)、焦 棒麥角堿（pyroclavine)、肋麥角堿（costaclavine)或epcostaclavine以及其前體裸麥 角堿-I和裸麥角堿醛，僅由相同或相似的三環(huán)系統(tǒng)或四環(huán)系統(tǒng)組成，類似麥角肽堿，但是 缺少肽結(jié)構(gòu)部分。但是，棒麥角素型生物堿也可以包含額外的取代基并因此不限于上文提 到的棒麥角素型生物堿。這類衍生物的例子是煙曲麥角堿類，如煙曲麥角堿A、B或C、異 煙曲麥角堿A或B、或者9-脫乙酰煙曲麥角堿C(Wallwey，C. *Li，S.M.2011，Nat.Prod. R印.，28:496-510))，其與狐茅麥角堿共有基本結(jié)構(gòu)，但是包含額外的取代基。煙曲麥角堿 類例如可以由青霉和曲霉例如煙曲霉產(chǎn)生（A.fumigatus) (Flieger 1997,見上述引文）。 而麥角科真菌例如麥角菌（C. purpurea) (Flieger 1997,見上述引文）具有產(chǎn)生麥角肽堿 的能力，所述麥角肽堿可以被認(rèn)為是麥角酸的衍生物，所述衍生物的前體之一是棒麥角素 型生物堿田麥角堿。比較ergopeptidens和棒麥角素型生物堿的前體，表明它們的生物 合成途徑早期階段非常相似并且可能例如是煙曲霉和麥角菌共有的，而該途徑中稍后步 驟在這兩個真菌物種中不同（Li 2006, Chembiochem 7:158 - 164 ;Panaccione 2005, FEMS Microbiol Lett 251:9-17 ;Schardl2006,見上述引文）。
[0004] 發(fā)酵生產(chǎn)棒麥角素型生物堿和甚至麥角類生物堿通常必須解決麥角類生物堿天 然產(chǎn)生者傾向于難以大規(guī)模培養(yǎng)的問題。這個問題的一個原因是以深層培養(yǎng)法發(fā)酵絲狀 真菌的技術(shù)問題。一些天然麥角類生物堿生產(chǎn)者甚至是植物屬如番薯屬（Ipomoea)，里韋 亞屬（Turbina)、銀背藤屬（Argyreia)和腺葉藤屬（Strictocardia)(例如 Periglandula 物種）的內(nèi)寄生菌或某些草本植物物種如黑麥草屬（Lolium)、高粱屬（Sorghum)或羊茅屬 (Festuca)的內(nèi)寄生菌（例如Neotyphodium和香柱菌屬（Epichloe)物種）。另外，許多天 然麥角類生物堿生產(chǎn)者僅在特定條件或在某些發(fā)育階段期間產(chǎn)生這些生物堿，并且甚至那 時它們也通常以低生產(chǎn)率生產(chǎn)。許多天然麥角類生物堿生產(chǎn)者產(chǎn)生一組不同的麥角類生物 堿，這造成以成本有效方式分離給定生物堿的問題并且甚至進一步降低特定目的生物堿的 產(chǎn)量。
[0005] 全化學(xué)合成麥角類生物堿或甚至復(fù)雜度較低的棒麥角素型生物堿迄今仍然代表 一項巨大挑戰(zhàn)：并且通常導(dǎo)致外消旋混合物的合成。
[0006] 為了克服這些問題，本發(fā)明提供重組微生物和重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物、 以及多核苷酸、多肽、載體、和使用這些重組微生物和重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物、多 核苷酸、多肽和載體用于生產(chǎn)棒麥角素型生物堿的方法。
[0007] 發(fā)明概述
[0008] 本發(fā)明提供重組微生物，所述重組微生物包含：
[0009] a)至少一種EasH活性，或
[0010] b)至少一種EasH和EasD活性，或
[0011] c)至少一種EasH和EasA還原酶活性，或
[0012] d)至少一種 EasH、EasD 和 EasA 活性，或
[0013] e)至少一種EasH和EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0014] f)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，或
[0015] g)至少一種 EasD、EasA 和 EasG 活性，或
[0016] h)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 還原酶和 EasG 活性，或
[0017] i)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 異構(gòu)酶和 EasG 活性，或
[0018] j)至少一種 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0019] k)a)至j)中至少兩者的組合，
[0020] 其中所述重組微生物不是天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物。
[0021] 本發(fā)明還提供重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物，所述生物具有至少一種上調(diào)的選 自以下的活性：DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，其中 EasA 活性是 EasA還原酶、EasA異構(gòu)酶、或EasA還原酶和EasA異構(gòu)酶活性。
[0022] 重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物包含至少一種上調(diào)的活性，所述上調(diào)的活性為選 自以下的一個或多個組的活性：
[0023] a)至少一種EasH活性，或
[0024] b)至少一種 EasH 和 EasD，或
[0025] c)至少一種EasH和EasA還原酶活性，或
[0026] d)至少一種 EasH、EasD 和 EasA 活性，或
[0027] e)至少一種EasH和EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0028] f)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasH、EasA 和 EasG 活性，或
[0029] g)至少一種 EasD、EasA 和 EasG 活性，或
[0030] h)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 還原酶和 EasG 活性，或
[0031] i)至少一種 DmaW、EasF、EasE、EasC、EasD、EasA 異構(gòu)酶和 EasG 活性，或
[0032] j)至少一種 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性。
[0033] 本發(fā)明還提供如上所述的重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物，所述生物具有至少一 種下調(diào)的選自EasD、EasH、EasA還原酶、EasA異構(gòu)酶和EasG活性的活性D本發(fā)明的另一 個實施方案是如本文中所述的重組微生物或重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物，所述生物包 含增大的DMPP供應(yīng)量和/或增大的Me-DMT供應(yīng)量，優(yōu)選地包含至少一種下調(diào)的ERG9或 ERG20活性，或至少一種上調(diào)的HMG-CoA還原酶活性，或包含至少一種下調(diào)的ERG9或ERG20 活性和至少一種上調(diào)的HMG-CoA還原酶活性。
[0034] 其他本發(fā)明的實施方案包含如上文所述的重組微生物或重組天然麥角類生物堿 生產(chǎn)生物，所述生物包含至少一個重組多核苷酸，所述重組多核苷酸編碼：
[0035] a)至少一種EasH活性，或
[0036] b)至少一種EasH和EasD活性，或
[0037] c)至少一種EasA還原酶或至少一種EasA異構(gòu)酶活性，或
[0038] d)至少一種EasD、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0039] e)至少一種EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0040] f)至少一種EasH、EasD、EasA還原酶、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0041] g)至少一種EasH、EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0042] h)至少一種EasH、EasD、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0043] i)至少一種 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0044] j)a)至i)中至少兩者的組合。
[0045] 本發(fā)明也提供重組多核苷酸，所述重組多核苷酸編碼：
[0046] a)至少一種EasH活性，或
[0047] b)至少一種EasH和EasD活性，或
[0048] c)至少一種EasA還原酶或至少一種EasA異構(gòu)酶活性，或
[0049] d)至少一種EasD、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0050] e)至少一種EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0051] f)至少一種EasH、EasD、EasA還原酶、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0052] g)至少一種EasH、EasD、EasA還原酶和EasG活性，或
[0053] h)至少一種EasH、EasD、EasA異構(gòu)酶和EasG活性，或
[0054] i)至少一種 DmaW、EasF、EasE 和 EasC 活性，
[0055] j)a)至i)中至少兩者的組合。
[0056] 本發(fā)明還提供如上文所述的重組微生物或重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物、或如 所述的重組多核苷酸，其中DmaW活性歸因于
[0057] a)包含與SEQ ID NO: 145和146具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0058] b)包含與SEQ ID NO: 147或190具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0059] c)包含與SEQ ID N0:l、19、20、179或180具有至少40%序列同一性的氨基酸序 列的多肽，或
[0060] d)包含與 SEQ ID 勵：1、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28具有至少90%序列 同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0061] e)由與SEQ ID NO: 102、122或123具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的 多肽，或
[0062] f)由與SEQ ID NO: 129或137具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽， 或
[0063] g)可以通過使用兩種PCR引物獲得的多核苷酸編碼的多肽，每種引物各包含選自 SEQ ID NO: 102、122或123所述序列的多核苷酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，或
[0064] h)由以下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 102、 122或123雜交，或
[0065] i)根據(jù)a)至h)中至少兩者、優(yōu)選地根據(jù)至少b)和c)的多肽，或
[0066] 根據(jù)a)至i)中至少之一的多肽，所述多肽可以從天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物獲 得。
[0067] 其他實施方案包含如本文所述的重組微生物或重組天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物、 或如上文所述的重組多核苷酸，其中EasF活性歸因于
[0068] a)包含與SEQ ID NO: 154具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0069] b)包含與SEQ ID N0:6、75或76具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽， 或
[0070] c)包含與 SEQ ID 勵:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84或85具有至少90%序 列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0071] d)由與SEQ ID NO: 107或120具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽， 或
[0072] e)由與SEQ ID NO: 134或142具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽， 或
[0073] f)由用兩種PCR引物可獲得的多核苷酸編碼的多肽，每種引物各包含下述多核苷 酸序列的至少15個連續(xù)核苷酸，所述多核苷酸序列選自SEQ ID NO: 107或120描述的序列， 或
[0074] g)由以下多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸在嚴(yán)格條件下與SEQ ID NO: 107或 120雜交，或
[0075] h)根據(jù)a)至g)中至少兩者、優(yōu)選地根據(jù)至少a)和b)的多肽，或
[0076] i)根據(jù)a)至h)中至少之一的多肽，所述多肽可從天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物獲 得。
[0077] 本發(fā)明的其他部分包括如上文所述的重組微生物或重組天然麥角類生物堿生產(chǎn) 生物、或如上文所述的重組多核苷酸，其中EasE活性歸因于
[0078] a)包含與SEQ ID NO: 153、185或191具有至少90%序列同一性、優(yōu)選地與SEQ ID NO: 191具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0079] b)包含與SEQ ID N0:5或64具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽，或
[0080] c)包含與 S