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用于產(chǎn)生棒麥角素型生物堿的基因和方法_5

文檔序號:8417190閱讀:來源:國知局
和195具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性并且在5£0 ID NO: 194的氨基酸位置18處具有酪氨酸,或 c) 包含與SEQ ID N0:2和/或31具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽,或 d) 包含與 SEQ ID 勵:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少90%序列 同一性的氨基酸序列的多肽,或 e) 由與SEQ ID NO: 103具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽,或 f) 由與SEQ ID NO: 130和/或138具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽, 或 g) 由多核苷酸編碼的多肽,所述多核苷酸可以通過使用兩個PCR引物獲得,其中每個 引物包含選自SEQ ID NO: 103、130和/或138所示序列的多核苷酸序列的至少15個連續(xù) 核苷酸,或 h) 由在嚴格條件下與SEQ ID NO: 103、130或138雜交的多核苷酸編碼的多肽,或 i) 根據(jù)a)至h)中至少兩者、優(yōu)選地根據(jù)至少b)和c)的多肽,或 j) 根據(jù)a)至i)中至少之一的多肽,所述可多肽從天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物獲得。
15. 根據(jù)權(quán)利要求1至6或8至14中任一項所述的重組微生物或重組天然麥角類生物 堿生產(chǎn)生物、或根據(jù)權(quán)利要求7中所述的重組多核苷酸,其中EasA異構(gòu)酶活性歸因于 a) 包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQ ID N0:148、149和150具有至少 90%序列同一性并且在SEQ ID NO: 149的氨基酸位置18處具有苯丙氨酸,或 b) 包含氨基酸序列的多肽,所述氨基酸序列與SEQ ID N0:193、194和195具有至少 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性并且在5£0 ID NO: 194的氨基酸位置18處具有苯丙氨酸,或 c) 包含與SEQ ID N0:2和/或31具有至少40%序列同一性的氨基酸序列的多肽,或 d) 包含與 SEQ ID 勵:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少90%序列 同一性的氨基酸序列的多肽,或 e) 由與SEQ ID NO: 103具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽,或 f) 由與SEQ ID NO: 130和/或138具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽, 或 g) 由多核苷酸編碼的多肽,所述多核苷酸可以通過使用兩個PCR引物獲得,其中每個 引物包含選自SEQ ID NO: 103、130和/或138所示序列的多核苷酸序列的至少15個連續(xù) 核苷酸,或 h) 由在嚴格條件下與SEQ ID NO: 103、130或138雜交的多核苷酸編碼的多肽,或 i) 根據(jù)a)至g)中至少兩者、優(yōu)選地根據(jù)至少a)和b)的多肽,或 j) 根據(jù)a)至h)中至少之一的多肽,所述多肽可從天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物獲得。
16. 根據(jù)權(quán)利要求1至6或8至15中任一項所述的重組微生物或重組天然麥角類生物 堿生產(chǎn)生物、或根據(jù)權(quán)利要求7中所述的重組多核苷酸,其中EasG活性歸因于 a) 包含與SEQ ID NO: 155和/或183具有至少90 %序列同一性、優(yōu)選地與SEQ ID NO: 183具有至少90%序列同一性的氨基酸序列的多肽,或 b) 包含與SEQ ID N0:7和/或86具有至少39%序列同一性的氨基酸序列的多肽,或 c) 包含與 SEQ ID N0:7、86、87、88、89、90、181、92、93 和 / 或 94 具有至少 70%序列同 一性的氨基酸序列的多肽,或 d) 由與SEQ ID NO: 108具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽,或 e) 由與SEQ ID NO: 135和/或143具有至少70%序列同一性的多核苷酸編碼的多肽, 或 f) 由多核苷酸編碼的多肽,所述多核苷酸可以通過使用兩個PCR引物獲得,其中每個 引物包含選自SEQ ID NO: 108、135和/或143所示序列的多核苷酸序列的至少15個連續(xù) 核苷酸,或 g) 由在嚴格條件下與SEQ ID NO: 108、135和/或143雜交的多核苷酸編碼的多肽,或 h) 根據(jù)a)至g)中至少兩者、優(yōu)選地根據(jù)至少a)和b)的多肽,或 i) 根據(jù)a)至h)中至少之一的多肽,所述多肽可從天然麥角類生物堿生產(chǎn)生物獲得。
17. 根據(jù)權(quán)利要求1至6或8至16中任一項所述的重組微生物,其中重組微生物是酵 母并且包含 a) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasH活性的多肽的多核苷酸,所述多 肽包含與 SEQ ID N0:8 和 / 或 95 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、 86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性 的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:8和/或95具有至少70%、72%、74%、76%、78%、 80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列同一性并且與SEQ ID NO: 156具有至少90%、優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨 基酸序列,甚至更優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:8和/或95具有至少70%、72%、74%、76%、 78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99 %或100 %序列同一性并且具有在如圖8所示的比對結(jié)果中100 %保守的全部氨基酸的 氨基酸序列; b) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasA還原酶活性的多肽的多核苷酸,所 述多肽包含與 SEQ ID 勵:2、31、32、33、34、35、36、37、38、39和/或40具有至少70%、72%、 74 %,76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:2、31、32、33、 34、35、36、37、38、39 和 / 或 40 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、 86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性 并且與SEQ ID N0:148、149和150具有至少95%、優(yōu)選地具有100%序列同一性以及在SEQ ID NO: 149的氨基酸位置18處具有酪氨酸的氨基酸序列, C)至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasG活性的多肽的多核苷酸,所述多 肽包含與 SEQ ID N0:7、86、87、88、89、90、181、92、93 和 / 或 94 具有至少 70%、72%、74%、 76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID NO:7、86、87、88、89、 90、181、92、93 和 / 或 94 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、 88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性并且與 SEQ ID NO: 183具有至少90%、優(yōu)選地至少95%序列同一性的氨基酸序列,更優(yōu)選地包含與 SEQ ID 吣:7、86、87、88、89、90、181、92、93和/或94具有至少70%、72%、74%、76%、78%、 80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列同一性并且具有在如圖IOa至圖IOc中所示的比對結(jié)果中100%保守的全部氨基 酸的氨基酸序列; d) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasD活性的多肽的多核苷酸,所述多肽 包含與 SEQ ID N0:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62 和 / 或 63 具有至少 70%、72%、74%、 76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:4、53、54、55、56、 57、58、59、60、62 和 / 或 63 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、 88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性并且與 SEQ ID NO: 152具有至少80%、優(yōu)選地至少81%序列同一性的氨基酸序列,更優(yōu)選地包含 與 SEQ ID 勵:4、53、54、55、56、57、58、59、60、62和/或63具有至少70%、72%、74%、76%、 78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%或100%序列同一性并且具有在如圖7a至圖7b中所示的比對結(jié)果中100%保守的全 部氨基酸的氨基酸序列, e) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasC活性的多肽的多核苷酸,所述多 肽包含與 SEQ ID N0:3 或 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51 和 / 或 52 具有至少 70%、 72 %,74 %,76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與3£〇10勵:3或 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51 和 / 或 52 具有至少 70 %、72 %、74%、76 %、78 %、 80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100%序列同一性并且與SEQ ID NO: 192具有至少85%、優(yōu)選地至少87%序列同一性的氨 基酸序列,更優(yōu)選地包含與 SEQ ID N0:3 或 41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51和/或 52 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、 93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性并且具有在如圖6&至圖6(1中 所示的比對結(jié)果中100%保守的全部氨基酸的氨基酸序列; f) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasE活性的多肽的多核苷酸,所述多 肽包含與 SEQ ID N0:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73 和 / 或 178 具有至少 70%、 72 %,74 %,76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96%、97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與56〇10勵:5、64、 175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至少70%、72%、74%、76%、78%、80%、 82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性并且與SEQ ID NO: 191具有至少70%、優(yōu)選地至少73%序列同一性的氨基酸序 列,更優(yōu)選地包含與 SEQ ID 勵:5、64、175、66、67、68、69、176、71、177、73和/或178具有至 少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、 95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性并且具有在如圖5 &至圖56中所示的比對 結(jié)果中100 %保守的全部氨基酸的氨基酸序列; g) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有EasF活性的多肽的多核苷酸,所述多 肽包含與 SEQ ID N0:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 和 / 或 85 具有至少 70%、72%、 74 %,76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %, 97%、98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:6、75、76、 77、78、79、80、81、82、83、84 和 / 或 85 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、 84%、86%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同 一性并且與SEQ ID NO: 154具有至少75%、優(yōu)選地至少79%序列同一性的氨基酸序列,更 優(yōu)選地包含與 SEQ ID N0:6、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84 和 / 或 85 具有至少 70%、 72 %,74 %,76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %, 96 %、97 %、98 %、99 %或100 %序列同一性并且具有在如圖4a至圖4c中所示的比對結(jié)果中 100%保守的全部氨基酸的氨基酸序列; h) 至少一個表達盒,所述表達盒包含編碼具有DmaW活性的多肽的多核苷酸,所述多肽 包含與 SEQ ID NO: 1、19、20、21、22、23、24、25、26、27 和 / 或 28 具有至少 70%、72%、74%、 76 %,78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %, 98%、99%或100%序列同一性的氨基酸序列,優(yōu)選地包含與SEQ ID N0:l、19、20、21、22、 23、24、25、26、27 和 / 或 28 具有至少 70%、72%、74%、76%、78%、80%、82%、84%、86%、 88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 或 100% 序列同一性并且與 SEQ ID NO: 190具有至少85%、優(yōu)選地至少89%序列同一性的氨基酸序列,更優(yōu)選地包含 與 SEQ ID 勵:1、19、20、21、22、23、24、25、26、27和/或28具有至少70%、72%、74%、76%、 78 %,80 %,82 %,84 %,86 %,88 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %, 99%或100%序列同一性并且具有在如圖3a至圖3d中所示的比對結(jié)果中100%保守的全 部氨基酸的氨基酸序列。
18. 根據(jù)權(quán)利要求5至6
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