一種發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明總體涉及通過微生物發(fā)酵提高微生物生長效率和產(chǎn)物例如醇類和酸類生 產(chǎn)效率的方法。更具體地，本發(fā)明涉及通過對含有一氧化碳的底物進(jìn)行微生物發(fā)酵產(chǎn)生醇， 尤其是乙醇的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乙醇正迅速地成為全世界的主要富含氫的液體運(yùn)輸燃料。2002年全球范圍內(nèi)的乙 醇消耗量估計為108億加侖。由于歐洲、日本、美國和幾個發(fā)展中國家對乙醇興趣增加，燃 料乙醇工業(yè)的全球市場也被預(yù)測會在未來急劇增長。
[0003] 例如，在美國，乙醇用于生產(chǎn)E 10, 一種乙醇在汽油中的10%的混合物。在E 10摻 合物中，乙醇組分作為氧合劑起作用，提高燃燒效率并且降低空氣污染物的產(chǎn)生。在巴西， 乙醇作為混合在汽油中的氧合劑或其自身作為純?nèi)剂希瑵M足了約30%的運(yùn)輸燃料需求。同 樣，在歐洲，圍繞溫室氣體（GHG)排放后果的環(huán)境問題已經(jīng)成為歐盟（EU)為成員國設(shè)置消 費可持續(xù)運(yùn)輸燃料（例如生物質(zhì)衍生的乙醇）的強(qiáng)制目標(biāo)的動力。
[0004] 絕大部分燃料乙醇通過傳統(tǒng)的基于酵母發(fā)酵的方法生產(chǎn)，所述方法使用源自作物 的碳水化合物（例如從甘蔗提取的蔗糖或從谷類作物提取的淀粉）作為主要的碳源。然而， 這些碳水化合物原料的成本受到它們作為人類食物或動物飼料的價值的影響，而栽培用于 乙醇生產(chǎn)的產(chǎn)淀粉或產(chǎn)蔗糖作物并不是在所有的地理區(qū)域中都是經(jīng)濟(jì)上可持續(xù)的。因此， 需要開發(fā)將更低成本的和/或更充足的碳源轉(zhuǎn)化為燃料乙醇的技術(shù)。
[0005] CO是有機(jī)材料（例如煤或油和油衍生產(chǎn)品）不完全燃燒的主要免費的、富含能量 的副產(chǎn)物。例如，有報道稱澳大利亞的鋼鐵工業(yè)每年產(chǎn)生并向大氣中排放超過500, 000噸 的CO0
[0006] 長期以來，人們認(rèn)為催化方法可用于將主要由CO和/或CO和氫（H2)構(gòu)成的氣體 轉(zhuǎn)化成多種燃料和化學(xué)制品。然而，微生物可也用于將這些氣體轉(zhuǎn)化為燃料和化學(xué)制品。 這些生物學(xué)方法，盡管通常比化學(xué)反應(yīng)慢，但與催化方法相比具有多個優(yōu)勢，包括更高特異 性、更高產(chǎn)率、更低能量消耗和對中毒的更強(qiáng)抗性。
[0007] 微生物將CO作為其唯一碳源生長的能力于1903年被首次發(fā)現(xiàn)。后來確定這是使 用自養(yǎng)生長的乙酰輔酶A (乙酰CoA)生物化學(xué)途徑（也被稱作Woods-Ljungdahl途徑和一 氧化碳脫氫酶/乙酰CoA合酶（C0DH/ACS)途徑）的生物的特性。已表明包括一氧化碳營 養(yǎng)生物、光合生物、產(chǎn)甲烷生物和產(chǎn)乙酸生物在內(nèi)的大量厭氧生物可將CO代謝為多種終產(chǎn) 物，即C0 2、H2、甲烷、正丁醇、乙酸鹽和乙醇。當(dāng)使用CO作為唯一碳源時，所有這類生物都產(chǎn) 生至少兩種這些終產(chǎn)物。
[0008] 已證明厭氧細(xì)菌（例如來自梭菌屬（Clostridium)的那些）可通過乙酰CoA生物 化學(xué)途徑從〇)、0) 2和!12產(chǎn)生乙醇。例如，10 00/684074? 117309、美國專利號5，173,429、 5, 593, 886和6, 368, 819、WO 98/00558和WO 02/08438中記載了從氣體產(chǎn)生乙醇的多個 揚(yáng)氏梭菌（Clostridium Ijunedahlii)菌株。還已知細(xì)菌自產(chǎn)乙醇梭菌（Clostridium autoethanogenum sp)可從氣體生產(chǎn)乙酉享（Aribini et al·，Archives of Microbiology 161，pp 345-351(1994))。
[0009] 然而，由微生物通過發(fā)酵氣體生產(chǎn)乙醇通常伴隨著同時產(chǎn)生乙酸鹽和/或乙酸。 由于一些可用的碳被轉(zhuǎn)化為乙酸鹽/乙酸而不是乙醇，使用這樣的發(fā)酵方法產(chǎn)生乙醇的效 率可能低于所期望的。并且，除非所述乙酸鹽/乙酸副產(chǎn)物可被用于一些其他目的，否則還 將引起廢物處理的問題。乙酸鹽/乙酸可被微生物轉(zhuǎn)化為甲烷，因此可能會增加溫室氣體 的排放。
[0010] 本領(lǐng)域已經(jīng)認(rèn)識到控制用于發(fā)酵的生物反應(yīng)器中用于培養(yǎng)細(xì)菌或微生物的液體 營養(yǎng)培養(yǎng)基的參數(shù)的重要性。具體地，2007年7月18日提交的并以引用的方式納入本文的 NZ 556615,描述了對所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH和氧化還原電位的控制。例如，在厭氧產(chǎn)乙 酸細(xì)菌的培養(yǎng)物中，通過將所述培養(yǎng)物的pH提高至高于約5. 7,同時將培養(yǎng)物的氧化還原 電位保持在低水平（_400mV或更低），與在更低pH的條件下相比，細(xì)菌以高得多的速度將作 為發(fā)酵副產(chǎn)物產(chǎn)生的乙酸鹽轉(zhuǎn)化為乙醇。NZ 556615還認(rèn)為，不同的pH水平和氧化還原電 位可用于優(yōu)化條件，該條件取決于所述細(xì)菌正在進(jìn)行的主要功能（即，生長、從乙酸鹽和含 有CO的氣態(tài)底物產(chǎn)生乙醇、或從含有氣體的底物產(chǎn)生乙醇）。
[0011] US 7078201和WO 02/08438也描述了通過改變其中進(jìn)行發(fā)酵的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基 的條件（例如，pH和氧化還原電位）改進(jìn)產(chǎn)乙醇的發(fā)酵方法。
[0012] 液體營養(yǎng)培養(yǎng)基的pH可以通過向培養(yǎng)基中加入一種或多種pH調(diào)節(jié)劑或緩沖液調(diào) 節(jié)。例如，堿如NaOH和酸如硫酸可被用于根據(jù)需要提高或降低pH。氧化還原電位可以通過 加入一種或多種還原劑（例如，甲基紫精（methyl viologen))或氧化劑調(diào)節(jié)。
[0013] 對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，類似的方法可被用于生產(chǎn)其他醇如丁醇。
[0014] 不考慮用于為所述發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)料的來源，當(dāng)供給中斷時會出現(xiàn)問題。更具體地，所 述中斷可對用于反應(yīng)的微生物的效率不利，并且在一些情況下，可對其有害。例如，當(dāng)工業(yè) 廢氣流中的CO氣體被用于發(fā)酵反應(yīng)以生產(chǎn)酸/醇時，可能存在不產(chǎn)生所述流的時候。此 時，用于該反應(yīng)的微生物可能進(jìn)入休眠（hibernation)。當(dāng)所述流再次可用時，可能在該微 生物達(dá)到進(jìn)行所需反應(yīng)的最大生產(chǎn)活力前存在滯后。
[0015] 硫源例如半胱氨酸和/或硫化物也可被用于在接種前獲得所需的所述厭氧培養(yǎng) 基的0RP。然而，這類還原劑較慢并具有有限的還原能力。另外，當(dāng)這些含硫化合物被用于 降低發(fā)酵培養(yǎng)基的ORP時，其自身被氧化。例如，半胱氨酸被氧化成二聚胱氨酸?？紤]到這 些化合物的還原形式比其氧化形式具有實質(zhì)上更高的作為硫源被微生物培養(yǎng)物消耗的生 物可用性。因此，當(dāng)硫源被用于降低發(fā)酵反應(yīng)的ORP時，可被微生物培養(yǎng)物利用的硫的實際 濃度會降低。因此，鑒定一種改進(jìn)的或者替代性的與使用含有一氧化碳?xì)怏w作為原料的厭 氧發(fā)酵系統(tǒng)一同使用的還原劑，是保證高醇產(chǎn)率和低過程操作成本的關(guān)鍵內(nèi)容。
[0016] 與主要營養(yǎng)素例如氮和磷一起，硫在厭氧微生物自產(chǎn)乙醇梭菌的發(fā)酵中具有重要 作用。硫?qū)ξ⑸飦碚f至關(guān)重要并且是一系列化合物和酶所必需的，所述化合物和酶使得 自產(chǎn)乙醇梭菌能夠?qū)O發(fā)酵成乙酸、乙醇和丁二醇并產(chǎn)生ATP用于生物質(zhì)增長。硫是一類 被稱為鐵氧化還原蛋白（ferredoxin)的生物化合物的一部分，并且是多種可將氣態(tài)CO固 定至乙酰-CoA的Wood-Ljundgahl酶的組成部分。通常，完全還原形式的硫被同化到功能 性蛋白中。所述微生物可以直接攝取H 2S或其硫氫根離子形式并將其同化至所需要的蛋白 質(zhì)中。許多所述微生物的含硫的酶也含有過渡金屬離子如Fe2+、Zn2+、Co2+和Μη 2+。由于這 些金屬的硫化物在中性PH值附近具有溶解度非常低的產(chǎn)物，因此游離H2S和/或游離過渡 金屬通常在這樣的環(huán)境中非常少見，因為大部分所述金屬離子被固定在不溶的金屬硫化物 中并因此不能被所述微生物獲得。
[0017] 本發(fā)明的目的是提供一種系統(tǒng)和/或方法，所述系統(tǒng)和/或方法至少在一定程度 克服上述缺陷，或至少為公眾提供可用的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0018] 在一大方面，本發(fā)明提供了一種提高細(xì)菌培養(yǎng)物生長效率的方法，所述方法包括 向所述培養(yǎng)物提供替代性硫源的步驟。
[0019] 在第二大方面，本發(fā)明提供了一種保持或提高由微生物培養(yǎng)物產(chǎn)生的一種或多種 產(chǎn)物的生產(chǎn)速度的方法，所述方法包括向所述培養(yǎng)物提供替代性硫源的步驟。
[0020] 在第三大方面，本發(fā)明提供了一種提高細(xì)菌培養(yǎng)物發(fā)酵效率的方法，所述方法包 括向培養(yǎng)物提供替代性硫源的步驟。
[0021] 第四方面，本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種產(chǎn)物的方法，所述 方法包括：
[0022] i.向生物反應(yīng)器提供含CO的氣態(tài)底物，該生物反應(yīng)器包含在液體營養(yǎng)培養(yǎng)基中 的一種或多種一氧化碳營養(yǎng)微生物的培養(yǎng)物；
[0023] ii.厭氧發(fā)酵所述底物，以產(chǎn)生一種或多種選自醇、酸及其混合物的產(chǎn)物；和
[0024] iii.回收一種或多種產(chǎn)物。
[0025] 在一個實施方案中，所述液體營養(yǎng)培養(yǎng)基包含至少一種選自S02、H2S0 3、Na2S204、S8、 Na2S、NaHS、半胱氨酸、NH4HSO3或（NH 4) 2S03的硫源。
[0026] 依據(jù)本發(fā)明的一個實施方案，本發(fā)明提供了提高微生物發(fā)酵包含CO的底物的效 率的方法，所述方法包括向營養(yǎng)培養(yǎng)基提供替代性硫源，使得硫可被一種或多種微生物利 用。
[0027] 在以上方面的具體實施方案中，所述替代性硫源選自亞硫酸（H2SO3)、Na 2S204、S8、 Na2S、NaHS、SO2、半胱氨酸、順碑03或（NH4) 2SO3。在具體的實施方案中，所述替代性硫源是 亞硫酸。
[0028] 在上述方面的具體實施方案中，所述硫源是工業(yè)過程的廢棄產(chǎn)物。所述工業(yè)過程 包括但不限于發(fā)電廠的煤炭燃燒或油燃燒。
[0029] 在具體的實施方案中，所述一種或多種含硫物質(zhì)可被微生物培養(yǎng)物利用。
[0030] 在另一個大方面，本發(fā)明提供了一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)一種或多種酸和/或醇 的方法，所述方法包括以下步驟：
[0031] i.提