一種斑馬魚(yú)原代胚胎細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的新方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于發(fā)育生物學(xué)與醫(yī)藥技術(shù)交叉領(lǐng)域，具體涉及一種斑馬魚(yú)原代胚胎細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的新方法。
【背景技術(shù)】
[0002]據(jù)美國(guó)心臟協(xié)會(huì)和我國(guó)國(guó)家心血管病中心2014年統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均表明，心血管疾病是所有致死因素中所占比例最大的疾病(約占40%)，是近年來(lái)人類健康的首要威脅。其中先天性心臟病由胚胎期心臟形成和發(fā)育缺陷所致，研宄心臟細(xì)胞譜系特化與分化過(guò)程是探宄其發(fā)病機(jī)制的重要依據(jù)。后天性心臟病主要與生活規(guī)律和飲食結(jié)構(gòu)等因素有關(guān)，發(fā)病后造成數(shù)億心肌細(xì)胞迅速死亡，而哺乳動(dòng)物損失的心肌無(wú)法有效的自我修復(fù)，最終導(dǎo)致心臟喪失功能。
[0003]斑馬魚(yú)是常用的發(fā)育和再生研宄的體內(nèi)模型，特別在心臟發(fā)育和再生研宄領(lǐng)域具有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，斑馬魚(yú)胚胎早期分裂迅速，受精后24小時(shí)即可形成自發(fā)跳動(dòng)的心臟，而小鼠在第8天，人類為第22天。其次，斑馬魚(yú)胚胎通體透明，可大量獲取且在體外發(fā)育，為篩選心臟發(fā)育相關(guān)的遺傳突變和小分子藥物提供了高效的模型。最后，斑馬魚(yú)的心臟具有異于哺乳動(dòng)物的再生能力，斑馬魚(yú)心臟的發(fā)育和再生研宄有助于篩選和開(kāi)發(fā)治療心臟病的新藥物和新方法。
[0004]目前現(xiàn)有的斑馬魚(yú)胚胎篩選誘導(dǎo)心肌細(xì)胞形成藥物的方法是建立在體內(nèi)模型上的，是利用斑馬魚(yú)整個(gè)胚胎篩選影響心肌細(xì)胞體內(nèi)發(fā)育的小分子藥物(鐘濤，用模式生物斑馬魚(yú)篩選誘導(dǎo)心肌細(xì)胞形成的藥物的方法，專利公開(kāi)號(hào):CN102520130A)。由于生物大分子難以穿透細(xì)胞膜和胚胎組織、器官等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，體內(nèi)篩選模型不適用于篩選影響心肌細(xì)胞形成的細(xì)胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等物質(zhì)。此外，體內(nèi)篩選模型在量化心肌細(xì)胞形成表型如心臟大小、心肌細(xì)胞數(shù)量等方面存在需固定胚胎方向、測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)等不便因素，使其難以進(jìn)行高通量篩選?，F(xiàn)雖已建有哺乳動(dòng)物多能干細(xì)胞系分化為心肌細(xì)胞的體外模型，但該類方法耗時(shí)至少為兩周，多能干細(xì)胞系長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和其干性的維持需要較高成本。現(xiàn)有的斑馬魚(yú)原代胚胎細(xì)胞體外模型是將原腸胚期的胚胎細(xì)胞置于含5%胎牛血清的L-15培養(yǎng)液中分化，可用于篩選影響內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)育和血管發(fā)生的藥物和因子(HaigenHuang, Anne Lindgren, Xinrong ffu, Ning-Ai Liu, Shou Lin.High-throughput screeningfor b1active molecules using primary cell culture of transgenic zebrafishembryos.Cell Reports, 2012, 2:695-704)。但該方法不能有效的分化出心肌細(xì)胞(一個(gè)384孔培養(yǎng)板的孔僅有6個(gè)表達(dá)心肌標(biāo)記基因的細(xì)胞，按該文獻(xiàn)中1600個(gè)胚胎分離的細(xì)胞供一個(gè)384孔培養(yǎng)板計(jì)算，相當(dāng)于4.2個(gè)胚胎分離的細(xì)胞僅能分化出6個(gè)表達(dá)心肌標(biāo)記基因的細(xì)胞，即I個(gè)胚胎得到1.4個(gè)心肌細(xì)胞)，并且于培養(yǎng)開(kāi)始后第5天喪失心肌標(biāo)記基因表達(dá)，因此無(wú)法有效的用于篩選影響心肌細(xì)胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理學(xué)測(cè)試。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種模式動(dòng)物斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的方法，通過(guò)檢測(cè)分化后心肌細(xì)胞特征基因的轉(zhuǎn)基因熒光標(biāo)記強(qiáng)度，能夠高通量的篩選促進(jìn)或抑制心肌細(xì)胞形成的生物大分子及小分子藥物。
[0006]本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
[0007]一種斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的方法，包括以下步驟:
[0008](I)斑馬魚(yú)雌、雄個(gè)體交配后收集胚胎，放入水中置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至囊胚期。
[0009](2)囊胚期的胚胎經(jīng)次氯酸鈉除菌后用E2溶液清洗，再用鏈霉蛋白酶處理去除絨膜。
[0010](3)去除絨膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎細(xì)胞培養(yǎng)液吹打成單個(gè)細(xì)胞。
[0011](4)離心棄去上清，再用胚胎細(xì)胞培養(yǎng)液清洗；
[0012](5)離心棄去上清，加入不含胎牛血清和魚(yú)血清的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液再懸浮細(xì)胞，將細(xì)胞懸液加入到明膠包被過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)容器，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.5?I小時(shí)后加入相應(yīng)體積比的胎牛血清和魚(yú)血清繼續(xù)培養(yǎng)，24?48h后即可得到能自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞；所述的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液的組分和配比如下:Leibovitz L_15培養(yǎng)基40.5% (v/v)、Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 28.35% (v/v)、Ham，s F12 培養(yǎng)基 12.15% (v/v)、胎牛血清15% (v/v)、魚(yú)血清I % (v/v)、蛋白濃度5mg/mL的斑馬魚(yú)胚胎粗提物1% (v/v)、5mg/mL胰島素 1% (v/v)，青霉素(10000IU/mL)鏈霉素(10mg/mL)溶液 1% (v/v)。
[0013]步驟(I)中使用的斑馬魚(yú)可為野生型或其他心臟特征基因標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)如 Tg(cmlc2:EGFP)、Tg(nkx2.5:EGFP)、Tg(cTnT:EGFP)等，熒光標(biāo)記也可為 DsRed,mCherry、Venus等不同類型和顏色焚光蛋白。
[0014]步驟(I)中斑馬魚(yú)雌、雄個(gè)體數(shù)目的比例優(yōu)選為1:2。
[0015]步驟(I)中斑馬魚(yú)囊胚期胚胎包括1000-細(xì)胞期、high、oblong、sphere、dome和30%外包期。
[0016]步驟(2)中所述的次氯酸鈉優(yōu)選濃度為0.003% (w/v)的次氯酸鈉，鏈霉蛋白酶優(yōu)選濃度為0.001% (w/v)的鏈霉蛋白酶。
[0017]步驟(2)和(3)中所述的E2溶液的組分和濃度如下:7.5mM NaCl、0.25mM KCl,0.5mM MgS04、0.075mM KH2P04、0.025mM Na2HP04、0.5mM CaCl2,0.35mM NaHCO3，過(guò)濾除菌。
[0018]步驟(3)和⑷中所述的胚胎細(xì)胞培養(yǎng)液的組分和配比如下-Leibovitz L_15培養(yǎng)基 42% (v/v)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基29.4% (v/v)、Ham’s F12 培養(yǎng)基 12.6% (v/V)、胎牛血清 15% (v/v)、青霉素(10000IU/mL)鏈霉素(10mg/mL)溶液 1% (v/v)。
[0019]步驟⑷和(5)中所述的離心的條件優(yōu)選為500g離心5分鐘。
[0020]步驟(5)中所述的明膠優(yōu)選濃度為0.1 %?0.2% (w/v)的明膠。
[0021]步驟(5)中細(xì)胞培養(yǎng)容器可為不同規(guī)格大小的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶以及4孔、6孔、12孔、24孔、48孔、96孔、384孔培養(yǎng)板。
[0022]步驟(5)中所述的斑馬魚(yú)胚胎粗提物優(yōu)選通過(guò)包含如下步驟的方法制備:取受精I(xiàn)?3天的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，用勻漿器研磨后，離心取上清，過(guò)濾即得斑馬魚(yú)胚胎粗提物。更優(yōu)選的，其通過(guò)包含如下步驟的方法制備:取受精后3天的斑馬魚(yú)幼魚(yú)，用勻漿器研磨后，15000g離心30min，取上清，經(jīng)0.2微米濾器過(guò)濾。
[0023]步驟(5)中所述的魚(yú)血清優(yōu)選通過(guò)包含如下步驟的方法制備:選取性成熟前的鯉科魚(yú)類，抽取其血液，靜止收集血清，離心取上清，過(guò)濾即得魚(yú)血清。更優(yōu)選的，其通過(guò)包含如下步驟的方法制備:選取性成熟前的草魚(yú)、鯽魚(yú)或其他鯉科魚(yú)類，抽取其血液后，37°C靜置lh，收集血清，100g離心15min，取上清，經(jīng)0.2微米濾器過(guò)濾。
[0024]步驟(I)和(5)中培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為26?30°C。
[0025]本發(fā)明是將斑馬魚(yú)囊胚期原代胚胎細(xì)胞置于心肌細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)液中體外分化為心肌細(xì)胞，僅需24?48小時(shí)，每誘導(dǎo)I萬(wàn)個(gè)原代胚胎細(xì)胞可獲得200個(gè)以上自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞團(tuán)(15?25個(gè)囊胚期胚胎可提供I萬(wàn)個(gè)胚胎細(xì)胞用于培養(yǎng)，相當(dāng)于I個(gè)胚胎可得到8.0?13.3個(gè)自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞團(tuán))，且能保持自發(fā)收縮特性20天。本發(fā)明方法心肌細(xì)胞的誘導(dǎo)分化效率既不過(guò)高也不是太低，可適用于促進(jìn)或抑制心肌細(xì)胞形成的因子篩選?；诒痉椒ǎㄟ^(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)與多功能酶標(biāo)儀的使用相結(jié)合可實(shí)現(xiàn)高通量篩選影響心肌細(xì)胞形成的生物大分子和小分子藥物。本發(fā)明不僅快速、經(jīng)濟(jì)，且具有更廣泛的適用性和更高的篩選效率。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)和有益效果:
[0027](I)與斑馬魚(yú)胚胎的體內(nèi)篩選模型相比，利用本發(fā)明可實(shí)現(xiàn)更快速和更高通量的篩選，且篩選的對(duì)象范圍更廣。通過(guò)多功能酶標(biāo)儀10分鐘內(nèi)即可讀取一塊384-孔培養(yǎng)板內(nèi)每孔細(xì)胞的熒光強(qiáng)度從而得知不同處理的影響，而基于整個(gè)胚胎的體內(nèi)篩選模型則需要對(duì)每個(gè)胚胎進(jìn)行觀察和分析，單位時(shí)間內(nèi)能分析樣本量有限。此外，因生物大分子難以穿透細(xì)胞膜和胚胎組織、器官等復(fù)雜結(jié)構(gòu)，體內(nèi)篩選模型僅適用于小分子藥物的篩選。而本方法基于體外分化模型，即將胚胎細(xì)胞直接暴露在處理?xiàng)l件下，可實(shí)現(xiàn)對(duì)包括細(xì)胞因子、多肽、蛋白、脂肪、多糖等在內(nèi)的生物大分子和小分子藥物進(jìn)行篩選。
[0028](2)與哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞體外分化模型相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于更經(jīng)濟(jì)、更快速得出篩選結(jié)果、更接近體內(nèi)心肌細(xì)胞分化的模式。哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞體外分化模型涉及多能干細(xì)胞系的長(zhǎng)期培養(yǎng)和維持，需要購(gòu)買多種維持干性的抑制因子，大幅度提高了篩選成本。此外哺乳動(dòng)物心肌細(xì)胞體外分化需要至少兩周時(shí)間。本發(fā)明利用斑馬魚(yú)胚胎易于大量獲取的優(yōu)勢(shì)，使用原代胚胎細(xì)胞進(jìn)行向心肌細(xì)胞的分化，無(wú)需長(zhǎng)期體外培養(yǎng)和維持胚胎細(xì)胞的多能性，且在24至48小時(shí)即可形成自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞。
[0029](3)與現(xiàn)有的斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞體外分化方法相比，本發(fā)明的優(yōu)勢(shì)在于誘導(dǎo)效率更高且心肌細(xì)胞特征維持時(shí)間更長(zhǎng)?，F(xiàn)有的斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞體外分化方法中分離I個(gè)胚胎中的細(xì)胞僅能得到1.4個(gè)心肌細(xì)胞，且其心肌細(xì)胞特征僅能維持5天，無(wú)法有效的用于篩選影響心肌細(xì)胞形成的因子，尤其是抑制因子和毒理學(xué)測(cè)試。本方法中分離I個(gè)胚胎中的細(xì)胞可得到8.0?13.3個(gè)心肌細(xì)胞團(tuán)，其心肌細(xì)胞特征可維持長(zhǎng)達(dá)20天。本方法的心肌細(xì)胞誘導(dǎo)分化效率既不過(guò)高、也不過(guò)低，促進(jìn)和抑制因子的篩選均可適用。
【附圖說(shuō)明】
[0030]圖1是Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞分化后2天(A)、4天(B、C)、7天(D)和14天(E)的能自發(fā)跳動(dòng)的GFP陽(yáng)性心肌細(xì)胞形態(tài)圖。(A-E)為明場(chǎng)觀察，(A’ -E’ )為488nm激發(fā)光下的暗場(chǎng)觀察，原始放大倍數(shù)20 X。
[0031]圖2是體外分化不同天數(shù)的心肌細(xì)胞自發(fā)跳動(dòng)頻率箱線圖。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)記錄的跳動(dòng)細(xì)胞團(tuán)數(shù)目為100?120個(gè)。
[0032]圖3是添加胰島素對(duì)斑馬魚(yú)胚胎細(xì)胞體外分化為心肌細(xì)胞的影響結(jié)果圖。(A)未添加胰島素(INS_)和添加胰島素(INS+)對(duì)Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因胚胎細(xì)胞分化為GFP陽(yáng)性心肌細(xì)胞的效果對(duì)比，原始放大倍數(shù)