20 X。(B)培養(yǎng)液中添加0、10、25或50 μ g/mL胰島素時，分化每14個胚胎細胞得到的自發(fā)收縮的細胞團數(shù)目，每個收縮的細胞團包含多個細胞。(C)培養(yǎng)液中添加0、10、25或50 μ g/mL胰島素時，每組GFP熒光強度相對于O μ g/mL胰島素組熒光強度的比值。(B、C)中數(shù)據(jù)為每組平均值土標準誤，*表示p〈0.05 *表示 p〈0.01 ; * * *表示 p〈0.0OOlo
【具體實施方式】
[0033]以下實施例進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本發(fā)明的范圍。
[0034]實施例1斑馬魚原代胚胎細胞分化為心肌細胞的特征觀察
[0035]動物:Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(可向我國國家斑馬魚資源中心購買)。
[0036]試劑:次氯酸鈉(NaClO)、NaCl、KCl、MgS04、KH2P04、Na2HP04、CaCl2,NaHC03 均購自國藥集團。鏈霉蛋白酶、明膠、胰島素，均購自sigma公司。Leibovitz L_15培養(yǎng)基、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、Ham’s F12培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素(10000IU/mL)鏈霉素(10mg/mL)溶液，均購自Hyclone公司。
[0037]斑馬魚胚胎粗提物的制備:取約500條受精后3天的幼魚，用勻漿器研磨后，15000g離心30min，取上清，經(jīng)0.2微米濾器過濾后，-70 °C下保存。
[0038]魚血清的制備:選取性成熟前的草魚，抽取其血液后，37°C靜置lh，收集血清，100g離心15min，取上清，經(jīng)0.2微米濾器過濾后，_70°C下保存。
[0039]實驗方法:
[0040](l)Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚雌、雄個體(雌雄比例1:2)交配后收集胚胎，放入水中置于26?30 °C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至囊胚期。
[0041](2)囊胚期的胚胎經(jīng)0.003% (w/v)次氯酸鈉除菌后用E2溶液清洗5次，再用0.001% (w/v)鏈霉蛋白酶處理10?20分鐘去除絨膜。E2溶液的組分和濃度為:7.5mMNaCU0.25mM KCU0.5mM MgS04、0.075mM ΚΗ2Ρ04、0.025mM Na2HP04、0.5mM CaCl2、0.35mMNaHCO3，過濾除菌。
[0042](3)去除絨膜的胚胎轉(zhuǎn)移至E2溶液清洗5次后收集至離心管，移除多余的E2溶液并加入胚胎細胞培養(yǎng)液，然后將胚胎吹打成單個細胞。所述的胚胎細胞培養(yǎng)液的組分和配比如下:Leibovitz L-15 培養(yǎng)基 42% (v/v)、Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 29.4% (v/v)、Ham’s F12培養(yǎng)基 12.6% (v/v)、胎牛血清 15% (v/v)、青霉素(10000IU/mL)鏈霉素(1mg/mL)溶液 I % (v/.V) ο
[0043](4) 500g離心5分鐘后，棄去上清加入胚胎細胞培養(yǎng)液并重復(fù)該步驟兩次。
[0044](5) 500g離心5分鐘棄上清后加入不含胎牛血清和魚血清的心肌細胞誘導培養(yǎng)液再懸浮細胞，細胞計數(shù)后以每孔4萬個細胞的密度鋪入0.2% (w/v)明膠包被過的細胞12孔細胞培養(yǎng)板，置于26?30°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.5小時后加入相應(yīng)體積比的胎牛血清和魚血清繼續(xù)培養(yǎng)。所述的心肌細胞誘導培養(yǎng)液的組分和配比如下:Leibovitz L-15培養(yǎng)基40.5% (v/v)、Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 28.35% (v/v)、Ham，s F12 培養(yǎng)基 12.15% (v/v)、胎牛血清15% (v/v)、魚血清1% (v/v)、蛋白濃度5mg/mL的斑馬魚胚胎粗提物1% (v/v)、5mg/mL 胰島素 1% (v/v)，青霉素(10000IU/mL)鏈霉素(10mg/mL)溶液 1% (v/v)。
[0045](6)在倒置顯微鏡明場和488nm激發(fā)光下觀察分化不同天數(shù)時心肌細胞的形態(tài)和特征基因cmlc2表達情況，并記錄心肌細胞自發(fā)收縮頻率。
[0046]實驗結(jié)果:培養(yǎng)起始24小時后可開始觀察到自發(fā)收縮的心肌細胞，48小時后可檢測到心肌特征基因cmlc2表達。心肌細胞形成效率為每培養(yǎng)14個原代胚胎細胞(10?15枚胚胎可提供14個胚胎細胞用于分化，因胚胎所處囊胚期的不同階段而不同)可獲得200個以上自發(fā)收縮的細胞團。隨著培養(yǎng)時間的增加，心肌細胞逐漸貼壁、增殖并發(fā)生去分化(圖1)。心肌細胞自發(fā)收縮頻率約為60次/分鐘，可維持20天(圖2)。實驗表明，本發(fā)明可有效的在體外將斑馬魚胚胎細胞分化為心肌細胞。
[0047]實施例2不同濃度胰島素對斑馬魚心肌細胞形成的影響。
[0048]動物:Tg(cmlc2:EGFP)轉(zhuǎn)基因斑馬魚(可向我國國家斑馬魚資源中心購買)。
[0049]試劑:胰島素，購自sigma公司。
[0050]實驗方法:心肌細胞誘導培養(yǎng)液中添加胰島素的濃度設(shè)置為10、25、50yg/mL，O y g/mL胰島素作為對照組，每組設(shè)置三個重復(fù)。按照實施例1中的方法于培養(yǎng)起始后第4天，利用熒光顯微鏡觀察添加胰島素對生成GFP陽性細胞的影響。倒置顯微鏡明場下記錄并計算各劑量組內(nèi)每14個胚胎細胞分化后所得的自發(fā)收縮心肌細胞團數(shù)量。通過多功能酶標儀檢測不同組內(nèi)的GFP熒光強度，將各劑量組熒光強度除以對照組的熒光強度均值即得到相對熒光強度。利用SAS軟件，統(tǒng)計分析每組間自發(fā)收縮心肌細胞團數(shù)量和相對熒光強度差異。
[0051]實驗結(jié)果:添加胰島素增加了 GFP陽性細胞的數(shù)量(圖3A)，顯著增加了自發(fā)收縮心肌細胞團的數(shù)量(P〈0.0001，圖3B)，并且顯著增加了 GFP熒光強度(p〈0.001，圖3C)，表明胰島素對斑馬魚心肌細胞形成具有促進作用。因此，本發(fā)明可檢測出不同濃度胰島素對心肌細胞形成的影響，表明本發(fā)明具有篩選影響心肌細胞形成的不同因子的應(yīng)用前景。
【主權(quán)項】
1.一種斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于包括以下步驟: (1)斑馬魚雌、雄個體交配后收集胚胎，放入水中置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至囊胚期； (2)囊胚期的胚胎經(jīng)次氯酸鈉除菌后用E2溶液清洗后，再用鏈霉蛋白酶處理去除絨膜； (3)去除絨膜的胚胎用E2溶液清洗后，用胚胎細胞培養(yǎng)液吹打成單個細胞； (4)離心棄去上清，再用胚胎細胞培養(yǎng)液清洗； (5)離心棄去上清，加入不含胎牛血清和魚血清的心肌細胞誘導培養(yǎng)液再懸浮細胞，將細胞懸液加入到明膠包被過的細胞培養(yǎng)容器，置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，0.5?I小時后加入相應(yīng)體積比的胎牛血清和魚血清繼續(xù)培養(yǎng)，24?48小時后得到心肌細胞；所述的心肌細胞誘導培養(yǎng)液的組分和配比如下:Leibovitz L-15培養(yǎng)基40.5% (v/v)、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基 28.35% (v/v)、Ham，s F12 培養(yǎng)基 12.15% (v/v)、胎牛血清 15% (v/v)、魚血清 1% (v/V)、蛋白濃度5mg/mL的斑馬魚胚胎粗提物1% (v/v)、5mg/mL胰島素1% (v/v)，青霉素鏈霉素溶液1% (v/v)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(I)中使用的斑馬魚為野生型或心臟特征基因標記的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(I)中斑馬魚雌、雄個體數(shù)目的比例為1:2。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(2)中所述的次氯酸鈉為0.003% (w/v)次氯酸鈉，鏈霉蛋白酶為0.001% (w/v)鏈霉蛋白酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于: 步驟(2)和(3)中所述的E2溶液的組分和濃度如下:7.5mM NaCK0.25mM KC1、0.5mMMgS04、0.075mM KH2P04、0.025mM Na2HP04、0.5mM CaCl2,0.35mM NaHCO3; 步驟(3)和(4)中所述的胚胎細胞培養(yǎng)液的組分和配比如下=Leibovitz L-15培養(yǎng)基42% (v/v)、Dulbecco 改良 Eagle 培養(yǎng)基 29.4% (v/v)、Ham，s F12 培養(yǎng)基 12.6% (v/v)、胎牛血清15% (v/v)、青霉素鏈霉素溶液1% (v/v)，所述的青霉素鏈霉素溶液中青霉素、鏈霉素的濃度分別為10000IU/mL、10mg/mL。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(4)和(5)中所述的離心的條件為500g離心5分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(5)中所述的明膠為0.1%?0.2% (w/v)明膠。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(5)中所述的斑馬魚胚胎粗提物通過包含如下步驟的方法制備:取受精I?3天的斑馬魚幼魚，用勻漿器研磨后，離心取上清，過濾；所述的魚血清通過包含如下步驟的方法制備:選取性成熟前的鯉科魚類，抽取其血液，靜止收集血清，離心取上清，過濾。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法，其特征在于:步驟(I)和(5)中培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)的溫度為26?30°C。
10.權(quán)利要求1-9任一項所述斑馬魚胚胎細胞體外分化為心肌細胞的方法在篩選促進或抑制心肌細胞形成的生物大分子或小分子藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種斑馬魚原代胚胎細胞體外分化為心肌細胞的新方法。斑馬魚交配后收集發(fā)育至囊胚期的胚胎，經(jīng)消毒及去絨膜處理后，吹打成單個細胞，再置于明膠包被過的細胞培養(yǎng)容器中用心肌細胞誘導培養(yǎng)液培養(yǎng)24至48小時后得到能自發(fā)收縮的心肌細胞。心肌細胞誘導培養(yǎng)液組分為Leibovitz L-15培養(yǎng)基、Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基、Ham's F12培養(yǎng)基、胎牛血清、魚血清、斑馬魚胚胎粗提物、胰島素、青霉素和鏈霉素。通過本發(fā)明每誘導1萬個原代胚胎細胞可獲得200個以上的心肌細胞團，且能保持自發(fā)收縮特性20天。本發(fā)明可實現(xiàn)經(jīng)濟、快速且高效地篩選對心肌細胞形成和發(fā)育有影響的生物大分子或小分子藥物。
【IPC分類】C12N5-073, C12Q1-02
【公開號】CN104745526
【申請?zhí)枴緾N201510193514
【發(fā)明人】周榮家, 肖遙, 程漢華
【申請人】武漢大學
【公開日】2015年7月1日
【申請日】2015年4月22日