脂肪組織細(xì)胞的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及褐色脂肪組織（BAT)細(xì)胞，以及它們的生產(chǎn)方法。尤其是，本發(fā)明涉及 源自人類成體干細(xì)胞，例如脂肪來源干細(xì)胞，的BAT細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 肥胖癥正成為全球人口日益關(guān)注的問題，因?yàn)楦右庾R(shí)到肥胖癥對(duì)健康的負(fù)面影 響。重度肥胖癥，其中一個(gè)人超出理想體重50公斤或更多，尤其引起嚴(yán)重健康問題的顯著 風(fēng)險(xiǎn)。因此，大量的注意力被聚焦到肥胖癥患者的治療上。
[0003] 食欲抑制通路已經(jīng)成為抗肥胖癥藥物開發(fā)的焦點(diǎn)，因?yàn)榉逝职Y被認(rèn)為是由于過多 的能量攝入超過了能量消耗。然而限制熱量攝入?yún)s誘導(dǎo)了抵抗體重減輕的代償性適應(yīng)。由 于營養(yǎng)感應(yīng)神經(jīng)元與認(rèn)知和行為成分之間有交叉作用（cross talk)，抑制食欲往往產(chǎn)生不 能接受的精神副作用。然而，由于調(diào)節(jié)脂肪生成的復(fù)雜性，較少有其它通路被得以探索。
[0004] 糖尿病是一種代謝疾病，其特征是血糖水平高且結(jié)合有相對(duì)的胰島素缺乏和胰島 素抵抗。大多數(shù)糖尿病患者患有2型糖尿病，這也稱為遲發(fā)性糖尿病，并且這種類型糖尿病 的發(fā)病率在過去的幾年中呈螺旋上升，這和肥胖癥的增加相一致。
[0005] BAT的功能是將食物中的能量轉(zhuǎn)化為熱量；生理學(xué)上而言，產(chǎn)生熱量以及最終在 代謝效率上的降低是有重要意義的。當(dāng)有機(jī)體需要額外的熱量時(shí)，例如出生后、進(jìn)入發(fā)熱狀 態(tài)期間、以及從休眠狀態(tài)清醒期間，便激活褐色脂肪組織來產(chǎn)生熱量，并且通過下丘腦起始 的通路來中樞控制產(chǎn)熱率。
[0006] BAT豐富存在于嚙齒動(dòng)物和人類新生兒中，但成體人類具有很少的BAT并且量隨 年齡而減少。BAT在嚙齒動(dòng)物和人類中的量與肥胖癥呈負(fù)相關(guān)，從而促進(jìn)BAT形成和功能的 基因存在缺陷的嚙齒動(dòng)物易于肥胖，并且在人類中在更年輕更瘦的個(gè)體中比更年長超重受 試者中觀察到更大量的BAT。因此，預(yù)期在肥胖癥個(gè)體中激活BAT組織或增加BAT質(zhì)量的 方法對(duì)減重和肥胖癥相關(guān)發(fā)病率的易感性有積極的作用。因此，已提出將BAT引入成體人 類來對(duì)抗肥胖癥的一些提議。例如，美國專利No. 6, 645, 229指出"褐色脂肪組織（BAT)在 調(diào)節(jié)能量消耗中發(fā)揮作用并且刺激BAT可導(dǎo)致患者變瘦。BAT激活受到交感神經(jīng)系統(tǒng)和其 它生理影響例如激素和代謝的調(diào)節(jié)。當(dāng)被激活時(shí)，BAT從血液供應(yīng)中去除游離脂肪酸（FFA) 和氧用于產(chǎn)生熱量"。新生兒BAT和成體人類的BAT在某些特性方面表現(xiàn)出差異。例如，新 生兒或經(jīng)典BAT源自表達(dá)Myf5的肌樣細(xì)胞譜系。所謂的米色或白棕色（brite)脂肪來自 不同的譜系，來自白色脂肪組織（WAT)。最近，已經(jīng)提出所有成體人類的BAT是米色/白棕 色，而不是經(jīng)典的BAT (Wu等人，2012 Cell 150:1-11)。
[0007] 激活或增加BAT的質(zhì)量對(duì)BAT相關(guān)疾病也有積極的作用-特別是糖尿病 (Vegiopoulos 等人，2010，Science 328(1158-61) ;Seale 等人 2001，JCI 121(96-105); Bostrom等人2012 Nature 481(463-68))。在最簡單的場(chǎng)景中，BAT可以通過減少肥胖 癥因而減少WAT囤積（depots)，從而減少其誘導(dǎo)的胰島素抵抗來改善II型糖尿病。然 而BAT也能改善代謝功能障礙，這超出了僅僅通過減少肥胖癥所預(yù)期的。這已得到事實(shí)證 明，即甚至當(dāng)小鼠沒有減重時(shí)，增加的BAT仍改善超重小鼠的胰島素敏感性。已顯示BAT 也能夠直接影響胰島細(xì)胞響應(yīng)葡萄糖時(shí)的胰島素分泌，改善葡萄糖動(dòng)態(tài)平衡（Guerra等 人，JCI，2001，108(1205-1213))。
[0008] 此外，最近顯示小鼠中的BAT移植強(qiáng)烈改善肥胖的、胰島素抵抗小鼠的代謝條件 (Liu等人（2013). Cell research, 1-4 ;Stanford 等人（2013) The Journal of clinical investigation，123 (1)，215 - 223)，并在鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠中恢復(fù)正常血糖及糖 耐量（Gunawardana&Piston, 2012Diabetes, 61 (3)，674 - 82)。除了充當(dāng)葡萄糖和能量消耗 器（sink)外，褐色脂肪細(xì)胞也很可能（在局部和/或在循環(huán)中）分泌對(duì)葡萄糖代謝/胰島 素敏感性和總能量平衡具有有益效果的因子，如IL-6 (Stanford等人2013)。
[0009] W02009137613描述了一種用于產(chǎn)生BAT的方法，這種方法基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即用 一種或更骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP)處理的干細(xì)胞抗原-1陽性（Sca-1+)的祖細(xì)胞分化成BAT 細(xì)胞或者向著BAT細(xì)胞分化。這些BAT細(xì)胞被描述為真正的BAT細(xì)胞，其具有響應(yīng)打開BAT 細(xì)胞產(chǎn)熱程序的兒茶酚胺刺激的完整能力。
[0010] Nishio等人CellMetabolism16:394, 2012描述了從人多能干細(xì)胞產(chǎn)生BAT細(xì) 胞。產(chǎn)生的BAT是經(jīng)典的，而不是白棕色譜系。
[0011] 最近，W02013/123214描述通過將乳內(nèi)動(dòng)脈源細(xì)胞（internal mammary artery-derived cells) (iMAC)暴露于指導(dǎo)脂肪生成的介質(zhì)中從動(dòng)脈源細(xì)胞產(chǎn)生人類BAT。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012] 由于設(shè)計(jì)用于治療性目的的BAT旨在被引入到患者中，因而能夠從患者自身組織 產(chǎn)生BAT將是有利的-即開發(fā)自體治療。因此，不適合使用ES細(xì)胞或胚胎/胎兒干細(xì)胞， 盡管它們具有潛在的產(chǎn)生BAT的潛能，理由是BAT在嬰兒中豐富但在成體中較少。由于常 規(guī)上通過吸脂除去成體脂肪組織，能夠從源自WAT的細(xì)胞產(chǎn)生BAT將是有利的。最后，由于 BAT旨在被重新引入到人體中，應(yīng)避免使用轉(zhuǎn)基因。
[0013] 因此，在本發(fā)明的第一方面，提供了一種分化的褐色脂肪組織（BAT)細(xì)胞，其產(chǎn)生 自脂肪來源成體干細(xì)胞。我們已經(jīng)開發(fā)出一種從存在于WAT中的脂肪來源干細(xì)胞（ADSC) 開始，從成體WAT產(chǎn)生BAT細(xì)胞的規(guī)程。所述成體干細(xì)胞不是轉(zhuǎn)基因的。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述成體干細(xì)胞是脂肪來源干細(xì)胞（ADSC)或祖細(xì)胞，例如前 脂肪細(xì)胞或adMSC (脂肪組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞）。
[0015] 在一個(gè)實(shí)施方式中，基礎(chǔ)UCP1的表達(dá)水平是白色脂肪組織（WAT)表達(dá)水平的至少 10倍。UCP1的表達(dá)是BAT表型的一般標(biāo)記物。在一個(gè)實(shí)施方式中，基礎(chǔ)UCP1的表達(dá)是WAT 中基礎(chǔ)UCP1表達(dá)的至少20倍。UCP1的表達(dá)能夠被cAMP及其類似物進(jìn)一步誘導(dǎo)。
[0016] 一般情況下，在根據(jù)本發(fā)明源自成體干細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)物中測(cè)量基因表達(dá)水平。 優(yōu)選地，該數(shù)字是相對(duì)于總細(xì)胞數(shù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的，并且因此是等量（equivalent)總細(xì)胞數(shù) 的培養(yǎng)物之間做出的相對(duì)比較。例如，通過將結(jié)果相對(duì)于培養(yǎng)物中的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行平均，能夠 計(jì)算每100個(gè)細(xì)胞或者每個(gè)細(xì)胞的表達(dá)水平。通過培養(yǎng)物中管家基因的表達(dá)水平推斷細(xì)胞 數(shù)。管家基因在所有的細(xì)胞中以相同水平表達(dá)。因此，每個(gè)培養(yǎng)物中基因表達(dá)水平相對(duì)于 管家基因表達(dá)水平進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，允許在不同的培養(yǎng)物中進(jìn)行比較。
[0017] 在一個(gè)實(shí)施方式中，BAT培養(yǎng)物以基礎(chǔ)水平表達(dá)roRM16,所述基礎(chǔ)水平相較于WAT 是提高的。在一些實(shí)例中，以比WAT中的基礎(chǔ)水平高約2倍的水平表達(dá)roRM16。
[0018] 在一個(gè)實(shí)施方式中，BAT培養(yǎng)物以基礎(chǔ)水平表達(dá)PPARGCla，所述基礎(chǔ)水平相較于 WAT中的基礎(chǔ)表達(dá)水平是提高的。例如，以比WAT中的水平高約20倍的水平表達(dá)PPARGCla; 在一些實(shí)例中，以比WAT中的水平高約40倍的水平表達(dá)PPARGCla。
[0019] 在一個(gè)實(shí)施方式中，當(dāng)和白色脂肪組織（WAT)相比時(shí)，BAT培養(yǎng)物不以提高的水平 表達(dá) CIDEA。經(jīng)典 BAT 基因（Eval、FBX031、EBF3、ZICl)和米色特異性基因（TMEM26、Tbxl5、 Shox2、HoxC9)的比較表明米色而非經(jīng)典BAT譜系用于本發(fā)明的BAT細(xì)胞。在一個(gè)實(shí)施方 式中，在米色脂肪中以更高水平表達(dá)的CD137,在本發(fā)明的細(xì)胞中沒有檢測(cè)到。
[0020] 在其它實(shí)施方式中，相較于WAT而言，觀察到一個(gè)或更多如下基因的提高的基礎(chǔ) 表達(dá)：TBX15、FBX031、EBF3、SH0X2 和 TMEM26。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于從成體脂肪來源干細(xì)胞衍生BAT細(xì)胞的 方法，包括在間充質(zhì)干細(xì)胞生長介質(zhì)中培養(yǎng)干細(xì)胞，以及將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至包含Dex、IBMX和 BMP-7的介質(zhì)中。
[0022] 在一個(gè)實(shí)施方式中，細(xì)胞未轉(zhuǎn)染有轉(zhuǎn)基因。
[0023] 根據(jù)本發(fā)明的方法是非常有效的。在一種實(shí)施方式中，如通過細(xì)胞培養(yǎng)物的針對(duì) BAT相關(guān)基因（如UCP-1)表達(dá)的抗體染色所評(píng)估的，20%或更多的干細(xì)胞分化成BAT細(xì)胞。 優(yōu)選地，25 %、30 %、40 %、50 %或更多的干細(xì)胞分化為BAT。
[0024] 在實(shí)施方式中的方法，包括將所述干細(xì)胞暴露于如下介質(zhì)組合：
[0025] (i)StemPro MSC SFM(invitrogen)和 BMP-7;
[0026] (ii)DMEM/F12(w Glutamax)、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP-7、三碘甲狀腺原氨酸（T3)、 地塞米松、羅格列酮和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX);以及
[0027] (iii)DMEM/F12(w Glutamax)、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、BMP-7、T3、地塞米松和羅格列 酮。
[0028]通過更新介質(zhì)來重復(fù)上述步驟（iii)。
[0029] 有利的，細(xì)胞以三天的間隔先后暴露于介質(zhì)。然而，通過經(jīng)驗(yàn)分析，針對(duì)特定的條 件能夠確定不同的時(shí)間規(guī)劃。
[0030] 在一個(gè)實(shí)施方式中，組分能夠以單一的混合物（cocktail)形式進(jìn)行混合，并用來 在單一步驟程序中區(qū)分ADSC。此處，這被稱為"混合"規(guī)程。