一種從臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法，尤其涉及從臍帶的羊膜下層組 織分離間充質(zhì)干細胞，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 干細胞是一類具有自我更新和多向分化潛能的細胞。根據(jù)個體發(fā)育過程中出現(xiàn)的 先后次序不同，分為胚胎干細胞（ESC)和成體干細胞（ASC)。胚胎干細胞是從囊胚的內(nèi)細胞 團中分離出來的細胞，能夠無限自我更新，可分化為內(nèi)、中、外3個胚層的各種細胞和組織。 但由于干細胞研宄的胚胎來源困難、本身具有致瘤性、免疫排斥及倫理等問題而限制了其 在臨床的應(yīng)用。隨著干細胞技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在己證實可以將成體的終末分化細胞通過導(dǎo)入 幾個關(guān)鍵的因子使其再編程為胚胎干細胞樣的細胞，這種細胞被稱為誘導(dǎo)性多能干細胞， 它可以繞過倫理道德問題，但因為需要借助病毒載體導(dǎo)入基因，有編程效率低、成瘤性等問 題，從而限制了它們在臨床上的應(yīng)用。成體干細胞是存在于胎兒、兒童和成人組織中的多能 干細胞的統(tǒng)稱，現(xiàn)在已經(jīng)在多種組織器官被發(fā)現(xiàn)，如造血干細胞、神經(jīng)干細胞、肝臟干細胞、 心臟干細胞及間充質(zhì)干細胞（MSC)等。一般認為，成體干細胞只能分化為其組織器官的細 胞類型，然而近幾年的研宄表明，這些干細胞的分化能力遠超過傳統(tǒng)觀點局限的范圍，如神 經(jīng)干細胞可以分化為血液細胞，臍帶血干細胞可以分化為神經(jīng)細胞等。
[0003] 間充質(zhì)干細胞是來源于中胚層的成體干細胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間 質(zhì)中，具有良好的增殖能力和多向分化潛能。在不同的誘導(dǎo)條件下，間充質(zhì)干細胞不但可分 化為軟骨、骨、骨骼肌、肌腱、脂肪等中胚層細胞，同時還可向外胚層的神經(jīng)細胞和內(nèi)胚層的 肝卵圓性細胞及多種細胞和組織分化。間充質(zhì)干細胞易于分離和培養(yǎng)，易于外源基因的導(dǎo) 入和表達，分泌的多種細胞因子具有調(diào)節(jié)免疫、支持造血的特性，免疫原性弱，遺傳背景穩(wěn) 定并且不受胚胎干細胞研宄中遇到的倫理問題限制。因此，間充質(zhì)干細胞是組織工程、基因 工程和細胞治療的理想種子細胞來源。
[0004]目前已經(jīng)進行的臨床試驗研宄證實，具有自我更新、多向分化潛能的間充質(zhì)干細 胞可以應(yīng)用于多種疾病的治療和康復(fù)。但是，所有的研宄或治療方案都必須建立在獲得足 量間充質(zhì)干細胞的基礎(chǔ)上，快速有效的分離間充質(zhì)干細胞作為種子細胞具有非常重要的研 宄價值和經(jīng)濟利益。在研宄和實際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)種子細胞存在種種問題，例如，自體骨髓雖然 存在大量的間充質(zhì)干細胞，但隨著年齡增大，自體骨髓中的間充質(zhì)干細胞數(shù)目會顯著降低， 且增殖能力也會大幅衰退，同時，從骨髓采集間充質(zhì)干細胞操作復(fù)雜，不宜應(yīng)用推廣。
[0005] 因此，研宄者開始尋找間充質(zhì)細胞的其他來源，其中，臍帶間充質(zhì)干細胞來源充 足、病毒污染概率低、免疫源性弱、細胞更為原始，也不存在社會、倫理和法律方面的爭議。 人臍帶連接于母體和胎兒之間，妊娠期間為胎兒提供營養(yǎng)，主要由三部分構(gòu)成：羊膜被覆上 皮、臍帶血管和位于兩者之間被稱為華通氏膠（Wharton' s Jelly)的黏液結(jié)締組織。臍帶 間充質(zhì)干細胞的主要的來源是華通氏膠和臍血。
[0006]目前對于臍帶間充質(zhì)干細胞分離的方法主要有貼壁法和酶消化法兩種。其中貼壁 法操作簡便，對實驗條件要求低，容易掌握。這種方法的缺點在于，獲得原代細胞的周期長， 液體的浮力使組織塊漂起，使其喪失了長出細胞的能力，減少了細胞數(shù)量，此外，產(chǎn)物中混 有部分內(nèi)皮細胞，需要通過后期的酶消化處理進行進一步的篩選。采用膠原酶消化法雖然 可在短時間內(nèi)獲得細胞，雜質(zhì)少，但費用較高，并且條件不易掌握，如果常溫中消化時間長 可能損傷細胞，致使細胞不易貼壁和傳代；如果消化時間短則液體粘稠，難以通過離心獲得 足夠量細胞。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種不采用消化酶又不同于常規(guī)貼 壁法的臍帶間充質(zhì)干細胞制備方法。本發(fā)明的發(fā)明人通過對臍帶中不同的間充質(zhì)干細胞來 源、實驗條件等進行了大量研宄和探索，發(fā)現(xiàn)從臍帶的羊膜下層組織可以制備出高純度、高 活性的間充質(zhì)干細胞。本發(fā)明的發(fā)明人還對實驗條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)分離出羊膜下層組 織后先不加細胞培養(yǎng)液在38. 5°C培養(yǎng)一段時間，然后再加入細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，可以顯著提 高間充質(zhì)干細胞的回收率。本發(fā)明的方法操作簡單，得到的間充質(zhì)干細胞純度高，具有增強 的自我更新及多向分化潛能。
[0008] 為了實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明提供一種從臍帶制備間充質(zhì)干細胞的方法，包括 下述步驟：（1)取臍帶樣品；（2)去除血管以及其周圍緊貼血管的組織；（3)制備臍帶組織 片；（4)分離羊膜下層組織；（5)對羊膜下層組織進行處理；(6)不加細胞培養(yǎng)液進行培養(yǎng)； (7)加入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；(8)胰酶消化；(9)過濾；（10)將濾液離心并去除上清，重新懸浮 獲得臍帶組織間充質(zhì)干細胞。
[0009] 優(yōu)選的，本發(fā)明的方法包括下述步驟：（1)取新生兒的臍帶，用含青霉素和鏈霉素 的磷酸鹽緩沖液反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶；（2)將干凈的臍帶用手術(shù) 刀縱向切開，用鑷子去除靜脈血管和動脈血管以及其周圍緊貼血管的組織；（3)將剩下的 組織攤平，臍帶內(nèi)側(cè)朝上，用鑷子小心剔除臍帶內(nèi)側(cè)膠質(zhì)部分，剝除干凈，直至剩下約1mm 厚度的組織片；(4)固定臍帶組織片靠表皮一側(cè)，用鑷子撕下臍帶內(nèi)側(cè)整齊的組織層即羊 膜下層組織，剩下薄薄一層透明的臍帶表皮即羊膜層組織；（5)將羊膜下層組織用剪刀剪 成約lcm 2的組織片，將靠近表皮側(cè)貼在培養(yǎng)皿中整齊排開；(6)不加細胞培養(yǎng)液，直接放置 于5% C02、38. 5°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置一小時后，倒置兩小時；(7)然后加入細胞培養(yǎng)液5mL，置 于5% C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，當組織片周圍的細胞達到80%融合時，將培養(yǎng)皿從培 養(yǎng)箱內(nèi)取出；(8)胰酶消化：先用磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，吸棄洗液，吸取含0. 25% 胰酶和0. 1 % EDTA的磷酸鹽緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3~5分鐘，再將細胞培養(yǎng)液 加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，使臍帶組織間充質(zhì)干細胞進入消化液中；(9)將消化液經(jīng)100 目滅菌濾網(wǎng)過濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細胞的濾液；（10)將濾液在 900rpm下離心5分鐘，去除上清，重新懸浮細胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細胞。
[0010] 優(yōu)選的，上述方法中的磷酸鹽緩沖液的組成如下：8g/L NaCl，0. 2g/L KC1，1. 15g/ L Na2HP04,0. 2g/L KH2P04, pH 7. 4。
[0011] 優(yōu)選的，上述方法中含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中，青霉素的濃度為l〇〇U/ ml，鏈霉素的濃度為0. lmg/ml。
[0012] 優(yōu)選的，上述方法中的細胞培養(yǎng)液是包含10-30%胎牛血清和5-151^/11^￡6?的 D-MEM/F12培養(yǎng)液。更優(yōu)選的，所述細胞培養(yǎng)液是包含20%胎牛血清和lOng/mL EGF的 D-MEM/F12 培養(yǎng)液。
[0013] 本發(fā)明還包括利用上述方法制備的間充質(zhì)干細胞。
[0014] 對于根據(jù)本發(fā)明所述方法制備的間充質(zhì)干細胞，按照"國際細胞療法協(xié)會"（ISCT) 制訂的標準進行生物學(xué)表型鑒定，表現(xiàn)出以下技術(shù)特征：
[0015] ①標準培養(yǎng)條件下粘附于塑料培養(yǎng)器皿成纖維樣生長；
[0016] ②表達 CD29, CD44, CD90, CD105,不表達 CD31，CD34, CD45, CD71 ;
[0017] ③體外可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)細胞。
[0018] 臍帶的羊膜下層組織是位于臍帶中羊膜下層部位的組織，即羊膜層和華通氏膠之 間的組織（參見圖1)。上述鑒定結(jié)果表明本發(fā)明從臍帶的羊膜下層組織中分離的干細胞屬 于間充質(zhì)干細胞，而不含造血干細胞。
[0019] 按本發(fā)明方法制備的原始干細胞因其所用材料來源和成品細胞的性能，可以解決 在干細胞應(yīng)用領(lǐng)域目前困擾醫(yī)學(xué)界的多項難題。本發(fā)明的方法不采用消化酶，避免了間充 質(zhì)干細胞分離過程中，消化酶對臍帶間充質(zhì)干細胞引入動物源蛋白和動物源病原物的污染 風(fēng)險，又比普通的貼片法獲得