更高純度的間充質(zhì)干細(xì)胞，去除了外胚層和內(nèi)胚層的雜質(zhì)細(xì) 胞干擾，提高了細(xì)胞純度。此外，本發(fā)明的方法經(jīng)過(guò)優(yōu)化，提高了從羊膜下層組織分離間充 質(zhì)干細(xì)胞的回收率，并且制備的間充質(zhì)干細(xì)胞具有更高的增殖和分化潛能，有利于其在后 期研宄和臨床應(yīng)用中發(fā)揮更加重要的作用。
【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1是臍帶結(jié)構(gòu)示意圖。
[0021] A表示羊膜，B表示羊膜下層組織，C表示華通氏膠，D表示血管周細(xì)胞，E表示臍帶 血管。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 為了使本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)特征、目的和有益效果有更加清楚的理 解，下面通過(guò)實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0023] 實(shí)施例1 :從臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞
[0024] 按照下述步驟從臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞：
[0025] (一）臍帶選?。哼x擇包括乙肝表面抗原、丙肝抗體、梅毒抗體和艾滋病毒抗體免 疫4項(xiàng)陰性，準(zhǔn)備進(jìn)行剖腹產(chǎn)的健康孕婦。在剖腹產(chǎn)手術(shù)時(shí)截取臍帶約10cm，速置于D-Hank 平衡液中送至細(xì)胞培養(yǎng)室，在超凈臺(tái)內(nèi)對(duì)臍帶進(jìn)行處理。
[0026](二）臍帶預(yù)處理：用含青霉素和鏈霉素（青霉素的濃度為100U/ml，鏈霉素的濃 度為 0? lmg/ml)的磷酸鹽緩沖液（8g/L NaCl，0. 2g/L KC1，1. 15g/L Na2HP04,0. 2g/L KH2P04， pH 7.4)反復(fù)沖洗臍帶組織，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶。
[0027] (三）去除血管：將干凈的臍帶用手術(shù)刀縱向切開(kāi)，用鑷子去除靜脈血管和動(dòng)脈血 管以及其周?chē)o貼血管的組織。
[0028] (四）制備組織片：將剩下的組織攤平，臍帶內(nèi)側(cè)朝上，用鑷子小心剔除臍帶內(nèi)側(cè) 膠質(zhì)部分，剝除干凈，直至剩下約1mm厚度的組織片。
[0029] (五）分離羊膜下層組織：固定臍帶組織片靠表皮一側(cè)，用鑷子撕下臍帶內(nèi)側(cè)整齊 的組織層即羊膜下層組織，剩下薄薄一層透明的臍帶表皮即羊膜層組織。
[0030] (六）組織處理：將獲得的羊膜下層組織用剪刀剪成約1cm2的組織片，將靠近表皮 側(cè)貼在培養(yǎng)皿中整齊排開(kāi)。
[0031] (七）無(wú)培養(yǎng)液培養(yǎng)：不加細(xì)胞培養(yǎng)液，直接放置于5% C02、38. 5°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置 一小時(shí)后，倒置兩小時(shí)。
[0032] (八）加入培養(yǎng)液培養(yǎng)：加入細(xì)胞培養(yǎng)液5mL，置于5 % C02、37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培 養(yǎng)七天左右，在培養(yǎng)皿中臍帶組織開(kāi)始有大量細(xì)胞爬出，十四天左右，待組織周?chē)?xì)胞達(dá)到 80 %的融合度時(shí)，將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出。
[0033](九）胰酶消化：用磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，每次用量10mL，吸棄洗液，吸取 lmL含0. 25%胰酶和0. 1% EDTA的磷酸緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘，再將5mL 含20 %牛血清和10ng/mL EGF的D-MEM/F12培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，使臍帶組織 間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液中。
[0034](十）過(guò)濾：消化液經(jīng)100目滅菌濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶組織間 充質(zhì)干細(xì)胞的濾液。
[0035] ( 十一）離心重懸：將濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，使用3mL D-MEM/ F12培養(yǎng)液重新懸浮均勻細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0036] 實(shí)施例2 :分離的間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定
[0037] 對(duì)利用實(shí)施例1的方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定檢測(cè)，鑒定檢測(cè)項(xiàng)目包括：
[0038] 1.形態(tài)學(xué)觀(guān)察：細(xì)胞貼壁成纖維樣生長(zhǎng)。
[0039] 2.生物學(xué)表型鑒定：利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表型。
[0040] ①將實(shí)施例1制備的間充質(zhì)干細(xì)胞分別與熒光標(biāo)記的抗⑶29、⑶31、⑶34、⑶44、 ⑶45、⑶71、⑶90和⑶105的抗體溫育，用FITC和PE標(biāo)記的小鼠IgG同型抗體作為對(duì)照；
[0041] ②4°C溫育45分鐘，離心收集細(xì)胞；
[0042] ③利用磷酸鹽緩沖液清洗細(xì)胞3次，然后將細(xì)胞重懸于300 y 1磷酸鹽緩沖液中， 進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析，計(jì)算細(xì)胞表面標(biāo)記物的陽(yáng)性率。
[0043] 表1顯示流式細(xì)胞儀分析結(jié)果。
[0044]表1
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種從臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，其特征在于，包括下述步驟：（1)取臍帶樣 品；（2)去除血管以及其周?chē)o貼血管的組織；（3)制備臍帶組織片；（4)分離羊膜下層組 織；（5)對(duì)羊膜下層組織進(jìn)行處理；(6)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；(7)加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)； (8)胰酶消化；(9)過(guò)濾；（10)將濾液離心并去除上清，重新懸浮獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì) 胞。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，包括下述步驟：（1)取新生兒的臍帶，用磷酸 鹽緩沖液反復(fù)沖洗干凈，去除殘留的血液，獲得干凈臍帶；(2)將干凈的臍帶用手術(shù)刀縱向 切開(kāi)，用鑷子去除靜脈血管和動(dòng)脈血管以及其周?chē)o貼血管的組織；（3)將剩下的組織攤 平，臍帶內(nèi)側(cè)朝上，用鑷子小心剔除臍帶內(nèi)側(cè)膠質(zhì)部分，剝除干凈，直至剩下約Imm厚度的 組織片；(4)在臍帶組織片靠表皮一側(cè)，固定臍帶組織片靠表皮一側(cè)，用鑷子撕下臍帶內(nèi)側(cè) 整齊的組織層即羊膜下層組織，剩下薄薄一層透明的臍帶表皮即羊膜層組織；（5)將羊膜 下層組織用剪刀剪成約Icm2的組織片，將靠近表皮側(cè)貼在培養(yǎng)皿中整齊排開(kāi)；（6)不加培 養(yǎng)液，直接放置于5%C02、38. 5°C培養(yǎng)箱內(nèi)，靜置一小時(shí)后，倒置兩小時(shí)；（7)然后加入細(xì)胞 培養(yǎng)液5mL，置于5%C02、37°C培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，當(dāng)組織片周?chē)募?xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)， 將培養(yǎng)皿從培養(yǎng)箱內(nèi)取出；(8)胰酶消化：先用磷酸鹽緩沖液清洗培養(yǎng)皿兩次，吸棄洗液， 吸取含〇. 25 %胰酶和0. 1 %EDTA的磷酸鹽緩沖液，加入到培養(yǎng)皿內(nèi)，消化3-5分鐘，再將細(xì) 胞培養(yǎng)液加入到培養(yǎng)皿中，反復(fù)吹打，使臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)入消化液中；(9)將消化 液經(jīng)100目滅菌濾網(wǎng)過(guò)濾，去掉臍帶組織片，獲得含臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞的濾液；（10)將 濾液在900rpm下離心5分鐘，去除上清，重新懸浮細(xì)胞，獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸鹽緩沖液的組成如下：8g/L的 NaCl，0. 2g/L的KC1，I. 15g/L的Na2HP04,0. 2g/L的KH2PO4,pH為 7. 4。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述含青霉素和鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中， 青霉素的濃度為l〇〇U/ml，鏈霉素的濃度為0.lmg/ml。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液是包含10-30 %胎牛血清和 5-15ng/mL的EGF的D-MEM/F12 培養(yǎng)液。
6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞培養(yǎng)液是包含20 %胎牛血清和 lOng/mL的EGF的D-MEM/F12 培養(yǎng)液。
7. -種利用權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種從臍帶制備間充質(zhì)干細(xì)胞的方法，以及利用該方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞。所述方法包括下述步驟：(1)取臍帶樣品；(2)去除血管以及其周?chē)o貼血管的組織；(3)制備臍帶組織片；(4)分離羊膜下層組織；(5)對(duì)羊膜下層組織進(jìn)行處理；(6)無(wú)細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；(7)加入細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)；(8)胰酶消化；(9)過(guò)濾；(10)將濾液離心并去除上清，重新懸浮獲得臍帶組織間充質(zhì)干細(xì)胞。利用本發(fā)明的方法制備的間充質(zhì)干細(xì)胞純度高，增殖和分化潛能大，在基礎(chǔ)研究和臨床治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。
【IPC分類(lèi)】C12N5-0775
【公開(kāi)號(hào)】CN104762257
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510171887
【發(fā)明人】劉擁軍, 李福彬, 徐萌, 余鵬程, 劉世勇, 劉洋
【申請(qǐng)人】云南和澤西南生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年4月13日