一種α-鼠李糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用
【專利說明】一種α-鼠李糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種極耐熱α -鼠李糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用。
[0003]
【背景技術(shù)】
[0004]α -鼠李糖苷酶(a -L-Rhamnosidase)是一種可以水解多種天然化合物糖基末端并釋放鼠李糖的糖苷水解酶，包括橙皮苷、蘆丁、槲皮苷、柚皮苷及一些萜烯類糖苷等天然化合物。由于α-鼠李糖苷酶廣泛地催化多種底物，使得其在眾多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，例如轉(zhuǎn)化柚皮苷、橙皮苷等使其苦味降低，從而改善果汁的口味；轉(zhuǎn)化蘆丁生成生物利用度更高、在抑制惡性腫瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2等方面生物活性更強(qiáng)的異槲皮素；轉(zhuǎn)化人參皂苷Re、Rg2等生成稀有且活性更強(qiáng)的人參皂苷Rgl、Rhl等。這些使得α -鼠李糖苷酶在食品、醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用的潛力。
[0005]α -鼠李糖苷酶早在1938年即被分離鑒定，經(jīng)過多年的研宄目前已有3000多種不同來源的α-鼠李糖苷酶被分離鑒定、克隆表達(dá)，但是至目前為止還沒有用于商業(yè)化的純的α-鼠李糖苷酶。僅有兩種分別來源于黑曲霉和青霉菌來源的菌株被用于商業(yè)化制備富含α-鼠李糖苷酶的酶制劑。我們分析了已有的研宄，發(fā)現(xiàn)其中存在的問題與局限性，并進(jìn)行了總結(jié):(I)真菌產(chǎn)α-鼠李糖苷酶大多是發(fā)酵后的粗酶液，其中不僅含有α-鼠李糖苷酶還有大量的β —葡萄糖苷酶等其它糖苷水解酶，在使用過程中無法避免的產(chǎn)生副產(chǎn)物而降低目的產(chǎn)物得率。⑵目前報道的大部分α-鼠李糖苷酶活力較低，無法適用于規(guī)?；纳a(chǎn)，同時真菌發(fā)酵產(chǎn)酶過程中影響因素較多不利于生產(chǎn)調(diào)控。(3)目前絕大部分不同來源的α -鼠李糖苷酶普遍為中溫酶，反應(yīng)溫度不高，當(dāng)需要提高催化體系溫度轉(zhuǎn)化一些溶解度不高的原料時，大部分酶無法在高溫條件下保持較高的熱穩(wěn)定性，影響生產(chǎn)效率。
[0006]綜合考慮上述問題，申請人認(rèn)為發(fā)掘耐熱α -鼠李糖苷酶基因，并通過基因工程手段得到基因重組菌，優(yōu)化表達(dá)條件從而較高地表達(dá)高溫型α -鼠李糖苷酶可能是有效的解決途徑。
[0007]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008]解決的技術(shù)問題:本發(fā)明針對上述局限性，提供一種改良的α -鼠李糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用，并通過基因工程技術(shù)獲得催化性能穩(wěn)定，成分單一的新型重組α -鼠李糖苷酶TPERha，該重組酶TPERha最適反應(yīng)溫度高、具有較高的熱穩(wěn)定性，在優(yōu)選條件下可高效表達(dá)目的蛋白，因此可在選擇性水解蘆丁、橘皮苷、柚皮苷、櫻桃苷、柴胡皂苷及其它連接α-鼠李糖苷的黃酮類化合物或萜類香氣前體化合物中的鼠李糖等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。
[0009]技術(shù)方案:一種α -鼠李糖苷酶，氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0010]編碼上述α -鼠李糖苷酶的核苷酸，核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0011]上述α -鼠李糖苷酶的制備方法，將SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導(dǎo)表達(dá)，并通過后續(xù)目的蛋白的純化而得。
[0012]所述制備方法的具體步驟如下:
1)、以提取的?識petrophilaDSM 13995基因組DNA為模板，用具有SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到SEQ ID N0.2所示的DNA片段;
2)、將得到的DNA片段和pET-28b分別用NheI和NotI進(jìn)行雙酶切，連接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重組質(zhì)粒；
3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109(DE3)，加入適量濃度的誘導(dǎo)劑IPTG于30°C下誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni2+親和層析柱純化即得。
[0013]包含上述α -鼠李糖苷酶的DNA片段的重組質(zhì)粒。
[0014]上述α -鼠李糖苷酶在選擇性水解蘆丁、橘皮苷、柚皮苷、櫻桃苷、柴胡皂苷及其它連接α-鼠李糖苷的黃酮類化合物或萜類香氣前體化合物中鼠李糖中的應(yīng)用。
[0015]有益效果:(I)本發(fā)明所述的α -鼠李糖苷酶TPERha最適反應(yīng)溫度高，熱穩(wěn)定性優(yōu)異；(2)本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶TPERha的優(yōu)選制備方法可達(dá)到目的蛋白的較高表達(dá)。
[0016]
【附圖說明】
[0017]為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。
[0018]圖1為實施例2純化的α-鼠李糖苷酶的純度鑒定結(jié)果圖；其中泳道M為蛋白Marker (購自Thermo scientific公司，貨號2661)，泳道I為純酶蛋白;泳道2為PET_20b轉(zhuǎn)化宿主菌空白對照的全細(xì)胞裂解液；泳道3為誘導(dǎo)表達(dá)后全細(xì)胞裂解液。
[0019]圖2為實施例3本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的定性測定結(jié)果(圖a, b, c, d)及黑曲霉來源的α-鼠李糖苷酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性的測定結(jié)果圖(圖e，f)，其中a為本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)pH的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為pH，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％ ;b為本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為溫度，單位攝氏度(°C)，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％; c為本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶的pH穩(wěn)定性的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為PH，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％; d為本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶的溫度穩(wěn)定性的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為保溫時間，單位小時(min)，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％。e為黑曲霉來源的α-鼠李糖苷酶最適反應(yīng)溫度的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為溫度，單位攝氏度(0C )，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％ ;f為黑曲霉來源的α -鼠李糖苷酶溫度穩(wěn)定性的測定結(jié)果圖，橫坐標(biāo)為保溫時間，單位小時(min)，縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位％。
[0020]圖3為實施例4本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)果圖，其中縱坐標(biāo)為相對酶活力，單位為％ ;橫坐標(biāo)為誘導(dǎo)條件的編號，其中1-5分別表示:1，30°C不加IPTG; 2，30°C加IPTG至終濃度0.0lmM; 3，30°C加IPTG至終濃度0.05mM ;4，30°C加IPTG至終濃度
0.1mM ;5，300CjJP IPTG 至終濃度 0.5mM。
[0021]圖4為實施例5本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶的產(chǎn)酶曲線圖，其中橫坐標(biāo)為誘導(dǎo)時間，單位(h);縱坐標(biāo)為α -鼠李糖苷酶活力，單位U/mL。
[0022]圖5為實施例6本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶水解橘皮苷的HPLC圖譜。圖5_a是滅活的重組a -L-鼠李糖苷酶酶液處理的橘皮苷的HPLC圖譜，圖5-b是重組a -L-鼠李糖苷酶處理的橘皮苷的HPLC圖譜。橘皮苷保留時間為4.830 min，而橘皮苷經(jīng)黑曲霉a -L-鼠李糖苷酶水解產(chǎn)物橘皮素單糖苷保留時間為5.457 min。
[0023]
【具體實施方式】
[0024]下面將結(jié)合本發(fā)明實施例，對本發(fā)明實施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅為本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025]本發(fā)明提供了一種新型α -鼠李糖苷酶，其氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，命名為 TPERha0
[0026]本發(fā)明也提供了編碼本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的DNA分子片段。由于密碼子的簡并性，可以存在很多種能夠編碼本發(fā)明所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列。
[0027]在一些實施方案中，本發(fā)明提供了可以編碼所述的α -鼠李糖苷酶TPERha的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0028]為了制備本發(fā)明所述酶蛋白，本發(fā)明還提供了本發(fā)明所述的α -鼠李糖苷酶的制備方法
在一些實施方案中，本發(fā)明所述的α -鼠李糖苷酶的制備方法，為獲得本發(fā)明所述的α -鼠李糖苷酶的DNA分子片段，將該DNA分子插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌，加入誘導(dǎo)量濃度的誘導(dǎo)劑IPTG后進(jìn)行誘導(dǎo)表