3、最適反應(yīng)溫度的測定
在60-100°C范圍內(nèi)，每隔5°C，分別測定酶活。緩沖溶液為100 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，PH 4.5，結(jié)果如圖2-b所示。
[0066]由圖2_b結(jié)果可見，本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的最適反應(yīng)溫度為90°C。
[0067]4、pH穩(wěn)定性的測定
將純化的重組酶TPERha在不同的pH (3.5-7.5，100 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液)下70°C處理I h，與不保溫酶的酶相比，結(jié)果如圖2-c所示。
[0068]由圖2-c結(jié)果可見，本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶在ρΗ3.5-7.5條件下75°C保溫Ih后仍能具有80%以上的殘余酶活力。
[0069]5、溫度穩(wěn)定性的測定
在pH 6.0下，使酶在70 0C ,80 °C, 90 °C溫度下分別保溫不同的時間(O，10，30，60，90，120 min)，再測定相對酶活，以未保溫(4°C保存)的酶活性為100%，結(jié)果如圖2_d所示:菱形表示70°C ;正方形表示80°C ;三角形表示90°C。
[0070]由圖2-d結(jié)果可見，本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶在70°C下保溫2h殘余酶活力高于85%。
[0071]6、與黑曲霉來源的α -鼠李糖苷酶最適溫度及溫度穩(wěn)定性比較
黑曲霉來源的重組a -L-鼠李糖苷酶的最適溫度:分別研宄了 20°C到45°C條件下的相對酶活。結(jié)果如圖2-e所示:黑曲霉來源的重組a-L-鼠李糖苷酶的最適溫度為35°C。該酶在30°C到35°C的范圍之間相對酶活均在50%以上，但當(dāng)溫度高于40°C時酶的活力就急劇下降。
[0072]將黑曲霉來源的重組a -L-鼠李糖苷酶在30°C、40°C的溫度下孵育不同的時間后，測定該酶的剩余的酶活力。結(jié)果如圖2-f所示:黑曲霉來源的重組a -L-鼠李糖苷酶在30°C表現(xiàn)出較高的穩(wěn)定性，孵育2h后仍有80%以上的相對酶活力；在40°C時，酶的活性急劇下降。
[0073]從以上結(jié)果可知，本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶最適反應(yīng)溫度顯著高于黑曲霉來源的重組α-L-鼠李糖苷酶的最適溫度，也是國內(nèi)外至目前報(bào)導(dǎo)的α-L-鼠李糖苷酶最高的最適反應(yīng)溫度；本發(fā)明所述α-鼠李糖苷酶溫度穩(wěn)定性顯著高于黑曲霉來源的重組a -L-鼠李糖苷酶的溫度穩(wěn)定性。
[0074]實(shí)施例4:本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶優(yōu)選制備方法
將重組質(zhì)粒pET-TPERha轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109(DE3)宿主菌(購自Novagen公司)，在含有卡那霉素(50 μ g/mL)的LB平板(LB培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L,NaCl5 g/L，瓊脂15 g/L)上經(jīng)過37°C培養(yǎng)過夜，挑轉(zhuǎn)化子到200 mL的LB培養(yǎng)基中(50 μ g/mL卡那霉素)37°C，200 rpm振蕩培養(yǎng)至0D600為0.6時，加入終濃度分別為OmM, 0.01mM, 0.05 mM，0.1 mM，0.5 mM異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)劑，30°C培養(yǎng)7h ；以及不加誘導(dǎo)劑IPTG在30°C培養(yǎng)7h，用高速冷凍離心機(jī)分別將2mL培養(yǎng)液在4°C下，以13, 000 rpm離心15 min，收集菌體。在菌體中加入一定體積緩沖溶液，重懸后，超聲波破碎細(xì)胞，獲得全細(xì)胞裂解液，去一定體積全細(xì)胞裂解液以13，000 rpm離心15 min,獲得上清液可溶性蛋白溶液，沉淀即為不溶性蛋白一包涵體。我們通過測定上清液中α-鼠李糖苷酶活力來評價(jià)不同表達(dá)條件的效果，結(jié)果如圖3所示。
[0075]圖3所示1-5分別表示:1，30°C不加IPTG; 2，30°C加IPTG至終濃度0.0lmM;3，30°C 加 IPTG 至終濃度 0.05mM ;4，30°C 加 IPTG 至終濃度 0.1mM ;5，30°C 加 IPTG 至終濃度0.5mM。由圖3可見，在30°C誘導(dǎo)下，不加IPTG時，重組酶幾乎無表達(dá)；但是隨著IPTG添加濃度越大，酶產(chǎn)率越低，可能是高濃度的誘導(dǎo)劑對菌體生長造成影響。由此可見，本發(fā)明所述表達(dá)α -鼠李糖苷酶的基因重組菌在30°C下加入0.0lmM誘導(dǎo)劑IPTG即可達(dá)到高效表達(dá)。
[0076]實(shí)施例5:本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶的產(chǎn)酶曲線。
[0077]將實(shí)施例2中所述，轉(zhuǎn)化后得到的帶有表達(dá)質(zhì)粒的重組菌轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)接到30mL含有卡那霉素50 μ g/mL的LB培養(yǎng)基中，經(jīng)過37°C，180prm培養(yǎng)過夜，以此作為種子液，接種到50mL含有卡那霉素50 μ g/mL的LB培養(yǎng)基至OD6tltl 0.1左右，37°C，180prm培養(yǎng)至OD6tltl0.8，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.0lmM，之后每2h取樣一次，收集菌體，破碎測定酶活力。
[0078]結(jié)果如圖4所示，重組菌在誘導(dǎo)表達(dá)前期酶活力偏低，一直到誘導(dǎo)至6h后，其α -鼠李糖苷酶活力達(dá)到最高，至4.5U/mL，繼續(xù)延長誘導(dǎo)時間至8h后酶活力開始下降，可能是培養(yǎng)時間延長之后菌體生長環(huán)境變化導(dǎo)致其對異源蛋白的表達(dá)能力減弱，所以誘導(dǎo)6h較優(yōu)。
[0079]實(shí)施例6:本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶對橘皮苷的水解
取純化后的a-L-鼠李糖苷酶0.5U，加入100 μ L 100 mmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，1yL 50 mmoL/L的橘皮苷(甲醇溶解)，添加去離子水至200 μ L，在90°C條件下孵育30min，取出12000rpm離心2min，加入200 μ L甲醇(分析純)混勻，經(jīng)0.22 μπι的有機(jī)濾膜過濾到色譜瓶中，使用HPLC分析，分析條件為:柱溫，30°C ;流速，1.0 mL/min ;進(jìn)樣量，5 UL ;檢測波長，270 nm ;流動相，甲醇:超純水=50:50 (V: V)。結(jié)果如圖5所示。
[0080]圖5-a是滅活的重組a -L-鼠李糖苷酶酶液處理的橘皮苷的HPLC圖譜。結(jié)果表明，本發(fā)明所述α -鼠李糖苷酶能在高溫條件下水解橘皮苷等含α -1, 6-鼠李糖苷鍵的黃酮類化合物。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種α -鼠李糖苷酶，其特征在于氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示。
2.編碼權(quán)利要求1所述α-鼠李糖苷酶的核苷酸，其特征在于核苷酸序列如SEQ IDN0.2所示。
3.權(quán)利要求1所述α-鼠李糖苷酶的制備方法，其特征在于將SEQ ID N0.2所示的DNA片段插入表達(dá)載體獲得重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后誘導(dǎo)表達(dá)，并通過后續(xù)目的蛋白的純化而得。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于步驟如下: 1)、以提取的?識petrophilaDSM 13995基因組DNA為模板，用具有SEQ IDN0.3所示的核苷酸序列的上游引物和具有SEQ ID N0.4所示的核苷酸序列的下游引物擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增得到SEQ ID N0.2所示的DNA片段; 2)、將得到的DNA片段和pET-28b分別用NheI和NotI進(jìn)行雙酶切，連接得到含有所述的α-鼠李糖苷酶的核苷酸序列的重組質(zhì)粒； 3)、將步驟2)得到的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌JM109(DE3)，加入適量濃度的誘導(dǎo)劑IPTG于30°C下誘導(dǎo)表達(dá)，離心收集菌體，破碎菌體后經(jīng)Ni2+親和層析柱純化即得。
5.包含權(quán)利要求2所述的α-鼠李糖苷酶的DNA片段的重組質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求1所述α-鼠李糖苷酶在選擇性水解蘆丁、橘皮苷、柚皮苷、櫻桃苷、柴胡皂苷及其它連接α-鼠李糖苷的黃酮類化合物或萜類香氣前體化合物中鼠李糖中的應(yīng)用。
【專利摘要】一種α-鼠李糖苷酶及其制備方法和應(yīng)用，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；該重組酶最適反應(yīng)溫度高、熱穩(wěn)定性好，在優(yōu)選條件下可高效表達(dá)目的蛋白，因此可在選擇性水解蘆丁、橘皮苷、柚皮苷、櫻桃苷、柴胡皂苷及其它連接α-鼠李糖苷的黃酮類化合物或萜類香氣前體化合物中的鼠李糖等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用。
【IPC分類】C12N9-24, C12N15-70, C12N15-56
【公開號】CN104762281
【申請?zhí)枴緾N201510102927
【發(fā)明人】趙林果, 解靜聰, 李琦, 裴建軍, 葛林
【申請人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月9日