一種瘧原蟲檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于檢測試劑盒技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種瘧原蟲熒光定量PCR檢測試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 瘧疾是全球最嚴(yán)重的由瘧原蟲引起的熱帶病之一，每年約有4億人感染，其中大 部分發(fā)生在撒哈拉以南的非洲（惡性瘧）和東南亞等國家（間日瘧）。瘧疾每年給非洲造 成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)120億美元。在針對瘧疾的治療過程中，病因的早期檢測顯得尤為的重 要，現(xiàn)在國內(nèi)外成熟的商品化瘧原蟲檢測試劑多為免疫學(xué)平臺產(chǎn)品。
[0003] 瘧原蟲的檢測主要涉及到兩個(gè)方面，核酸的提取和核酸的擴(kuò)增檢測。
[0004] 國內(nèi)成熟產(chǎn)品中，外周血中核酸的提取，目前主要有三種方法：1)直接煮沸法：向 外周血中加入核酸裂解液，直接煮沸，高速離心，上清即為模板。其優(yōu)點(diǎn)是易于操作；缺點(diǎn)是 不能有效去除外周血中抑制PCR的因素，弱陽性經(jīng)常無擴(kuò)增。2)濃縮煮沸法：先將外周血 濃縮，再加裂解液，煮沸，高速離心，上清為模板，這種方法是目前國內(nèi)臨床通用的方法，其 優(yōu)點(diǎn)是能部分去除"直接煮沸法"中無法去除的抑制性因素；缺點(diǎn)是不同廠家的濃縮效果不 一樣，有的可以看到沉淀，有的無法看到?？吹玫匠恋淼氖且?yàn)閷⒉《九c蛋白都濃縮了，導(dǎo) 致后面加入裂解液時(shí)很難充分混勻；無法看到沉淀的，使操作者無法確定吸棄雜質(zhì)時(shí)會不 會把病毒一起吸棄，而導(dǎo)致病毒損失，導(dǎo)致成為假陰性。3)柱提取法：外周血通過裂解，過 柱后核酸吸附到膜上，通過兩次洗滌，最后洗脫下來的為模板。這種方法相對前兩種提取方 法而言，提取的核酸純度大大提高，但步驟繁瑣，時(shí)效性差。
[0005] 臨床上檢測瘧原蟲的方法目前主要是免疫學(xué)方法，而基于實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) (探針法）對瘧原蟲進(jìn)行檢測的報(bào)導(dǎo)較少。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是近年來發(fā)展迅速的 一種核酸檢測技術(shù)；它使用一種帶有熒光檢測裝置的PCR擴(kuò)增儀，熒光檢測裝置能夠按照 一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，通過檢測熒光信號的動 態(tài)變化實(shí)時(shí)反映PCR的每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后可通過軟件自動分析獲得擴(kuò)增曲 線，根據(jù)擴(kuò)增曲線與熒光閾值線的交點(diǎn)（即Ct值）以及擴(kuò)增曲線的形狀，可以判斷陰陽性 結(jié)果。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應(yīng)體系中增加了熒光探針。探針發(fā)出的熒光信號被熒 光檢測裝置收集。隨著擴(kuò)增的進(jìn)行，熒光信號隨著目的片段的擴(kuò)增而呈現(xiàn)線性增強(qiáng)。實(shí)驗(yàn) 結(jié)束后，可以通過熒光PCR儀自帶的軟件自動分析數(shù)據(jù)，可以獲得陰陽性結(jié)果。因此，該技 術(shù)在靶多核苷酸樣品的檢測分析中，已逐漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應(yīng)用。
[0006] 國內(nèi)已有多種基于免疫學(xué)方法用于瘧原蟲檢測的試劑盒，但暫無實(shí)時(shí)熒光定量 PCR技術(shù)檢測瘧原蟲的試劑盒應(yīng)用于臨床檢測中。已有的這些試劑盒所提供的瘧原蟲提 取和檢測方法有很多不足之處：1)核酸提取過程較復(fù)雜，樣本處理耗時(shí)長，且在處理樣本 時(shí)，需要經(jīng)過多個(gè)步驟，樣本中的DNA存在損耗，尤其對于高濃度的樣本，裂解不充分、富集 不完全，會造成DNA的大量丟失導(dǎo)致樣本丟失驗(yàn)證，核酸提取效率低；2)檢測靈敏度低，在 5000 C〇pieS/ml左右；3) -般沒有預(yù)防物污染的措施；4)沒有熒光歸一化校正系統(tǒng)，結(jié)果判 定受主觀因素影響較大；5)方法學(xué)時(shí)效性差且通量小。
[0007] 因此，本領(lǐng)域需要研宄開發(fā)一種操作簡便、耗時(shí)短、高效、安全可靠且檢測靈敏度 高的瘧原蟲檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種瘧原蟲熒光定量PCR檢測試劑盒，該試劑 盒包括用于檢測的探針、用于擴(kuò)增的上游引物以及下游引物、PCR緩沖液和DNA聚合酶。該 試劑盒操作簡便，靈敏度高，并可預(yù)防PCR產(chǎn)物污染，具有很好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性， 利用該試劑盒進(jìn)行瘧原蟲熒光定量PCR檢測，可以確定血液樣本中瘧原蟲有無，可為靈敏、 早期診斷是否被瘧原蟲感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
[0009] 因此，本發(fā)明提供一種瘧原蟲檢測試劑盒，所述試劑盒中包括用于熒光定量PCR 檢測的PCR反應(yīng)液。具體地，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物和下 游引物序列，且所述上游引物的序列為：5' -CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3';所述下游引物 的序列為：5' -CCAGAACCCAAAGACITTGAITTC-3'。
[0010] 在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸檢測的探針 序列，且所述探針序列為：5 ' -TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3 '。本發(fā)明中，所述探針的 羧基端用熒光素標(biāo)記，并對羥基端用猝滅基團(tuán)修飾，其中所述熒光素選自FAM、TET、JOE和 ffiX，所述猝滅基團(tuán)選自BHQ1、DABCYL、TAMRA、BHQ2和BHQ3。優(yōu)選所述熒光素為FAM，所述 猝滅基團(tuán)為BHQ1。
[0011] 本發(fā)明的試劑盒，因?yàn)椴捎昧松鲜鎏结樅蜕舷掠我?，所以具有很好的特異性?靈敏性，應(yīng)用本發(fā)明提供的試劑盒，可以對血液樣本中的瘧原蟲進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測定，特異 性好，能夠檢測出是否存在瘧原蟲感染。
[0012] 在本發(fā)明的另一種實(shí)施方式中，所述試劑盒中還含有40~200mmol/L的參比染 料。本發(fā)明中，所述參比染料包括R0X參比染料（購自Roche公司）或其他適用于熒光定 量PCR的參比染料。加入R0X參比染料起到明顯的歸一化效果，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn) 定性有明顯改善。
[0013] 本發(fā)明中，所述試劑盒中還包括酶混合液和瘧原蟲陰性對照，且所述酶混合液包 含濃度為1~5U/ y 1的耐熱DNA聚合酶（Taq酶）和濃度為0? 05~0? 2U/ y 1的尿嘧啶DNA 糖基化酶（UNG酶）。其中UNG酶具有降解含有dU的PCR產(chǎn)物的功能，利用UNG酶和PCR反 應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防PCR產(chǎn)物污染的作用。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，所述瘧原 蟲陰性對照為不含有瘧原蟲任意一種型別的滅活陰性外周血。
[0014] 本發(fā)明的PCR反應(yīng)中優(yōu)選地包括PCR反應(yīng)緩沖液。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，所 述10XPCR反應(yīng)緩沖液包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽、30mmol/L氯化 鎂、500mmol/L氯化鉀、0. 2ml/100ml曲拉通、和10ml/100ml甲酰胺（各組分購自Sigma公 司
[0015] 本發(fā)明還提供一種使用如上所述的試劑盒進(jìn)行瘧原蟲熒光定量PCR檢測的方法， 其包括：步驟K，將PCR反應(yīng)液與酶混合液混合后制成PCR混合液；步驟L，將PCR混合液離 心處理，然后將經(jīng)過離心處理的PCR混合液加入多個(gè)反應(yīng)管，并向含有PCR混合液的反應(yīng) 管中分別加入陰性對照或待測樣本核酸，制成PCR反應(yīng)樣品，蓋好管蓋；步驟M，在熒光定量 PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，檢測并記錄樣品的擴(kuò)增曲線與閾值線；步驟N，根據(jù)樣品的 擴(kuò)增曲線形狀、擴(kuò)增曲線與閾值線是否存在交點(diǎn)Ct，以及Ct值大小進(jìn)行瘧原蟲分析；其中， 在步驟K中，PCR反應(yīng)液的加入量為42~43 y 1/人份，酶混合液的加入量為1~2 y 1/人 份。
[0016] 優(yōu)選地，在步驟L中，每個(gè)反應(yīng)管中陰性對照或待測樣本核酸的加入量為3~ 5 y 1 〇
【具體實(shí)施方式】
[0017] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面將結(jié)合實(shí)施例來詳細(xì)說明本發(fā)明，這些實(shí)施例僅 起說明性作用，并不局限于本發(fā)明的應(yīng)用范圍，下列實(shí)施例中未提及的具體實(shí)驗(yàn)方法，通常 按照常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行。
[0018] 實(shí)施例1
[0019] 本實(shí)施例提供一種瘧原蟲熒光定量PCR檢測試劑盒，它包括如下組分。
[0020] 1)用于檢測瘧原蟲的引物探針序列（Invitrogen公司合成），其源于瘧原蟲各型 別的保守區(qū)域。
[0021] 上游引物 PT-F :5' -CGACTAGGTGTT