GGATGAAAGTGT-3' ；
[0022] 下游引物 PT-R : 5 ' -CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3 ' ；
[0023] 探針 PT-P :5' -TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3' ；
[0024] 優(yōu)選地，探針羧基端用FAM標(biāo)記，羥基端用BHQ1猝滅基團(tuán)修飾。在本發(fā)明的其他 實(shí)施方式中，還可以選用TET、JOE、HEX等熒光素標(biāo)記，配合選用DABCYL、TAMRA、BHQ2、BHQ3 等猝滅基團(tuán)。
[0025] 2)10XPCR反應(yīng)緩沖液：包括pH7. 5的200mmol/L三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽， 30mmol/L氯化鎂，500mmol/L氯化鉀，0. 2ml/100ml曲拉通和10ml/100ml甲酰胺（各組分購(gòu) 自Sigma公司）；
[0026] 3)脫氧核糖核苷三磷酸：為dATP、dCTP、dGTP和dTTP (均購(gòu)自Promega公司）；
[0027] 4) dUTP :購(gòu)自Promega公司，它與尿嘧啶DNA糖基化酶配合用于預(yù)防PCR產(chǎn)物污 染。
[0028] 上述組分1)~4)可混合構(gòu)成PCR反應(yīng)液。
[0029] 5) R0X參比染料：R0X參比染料購(gòu)自Roche公司，或使用其他適用于熒光定量PCR 的參比染料。加入R0X參比染料起到明顯的歸一化效果，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和穩(wěn)定性有 明顯改善。
[0030] 6)酶混合液：購(gòu)自Promega公司，其中酶混合液包含濃度為1~5U/ y 1的耐熱DNA 聚合酶（Taq酶）和濃度為0. 05~0. 2U/ y 1的尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG酶）；其中UNG 酶具有降解含有dU的PCR產(chǎn)物的功能，利用UNG酶和PCR反應(yīng)液中的dUTP可以起到預(yù)防 PCR產(chǎn)物污染的作用。
[0031] 7)瘧原蟲(chóng)陰性對(duì)照：不含有瘧原蟲(chóng)各型別中任意一種的滅活陰性外周血。
[0032] 實(shí)施例2
[0033] 本實(shí)施例為使用實(shí)施例1的試劑盒進(jìn)行瘧原蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)。
[0034] 1 ?試劑準(zhǔn)備：
[0035] 1)提取待測(cè)樣本中核酸：
[0036] ①根據(jù)樣本數(shù)取相應(yīng)量的1. 5ml離心管，做好標(biāo)記。
[0037] ②取血液樣品200ml，加入2-2. 5倍體積的滅菌生理鹽水，顛倒混勻，振蕩至徹底 混勻。
[0038] ③加入200ul裂解液，混勻，振蕩至徹底混勻。
[0039] ④將上一步得到的溶液，99度放置lOmin，其間顛倒混勻數(shù)次。
[0040] ⑤將上一步得到的溶液，12000rpm離心5min，將上清收集到離心管中。
[0041] ⑥在PCR管蓋上做好標(biāo)記，低速離心數(shù)秒，而后分別加入已提取的待測(cè)樣品3~ 5 y 1，使反應(yīng)總體系為50 y 1，低速離心數(shù)秒。每次實(shí)驗(yàn)可設(shè)置一個(gè)陰性質(zhì)控，作為產(chǎn)品使用 的質(zhì)量控制。
[0042] 2)PCR反應(yīng)液：包含10XPCR反應(yīng)緩沖液，0. 2mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸， 40mmol/L~200mmol/LR0X參比染料，0. 2ymol/L~0. 4ymol/L用于革巴多核昔酸擴(kuò)增的 上游引物PT-F以及下游引物PT-R，0? 2ymol/L~0? 4ymol/L用于檢測(cè)靶多核苷酸的探針 PT-P；
[0043] 3)PCR-mix :根據(jù)待測(cè)樣本和陰性對(duì)照的量，按比例（PCR反應(yīng)液42~43 y 1/人份 +酶混合液1~2 y 1/人份）取相應(yīng)量的PCR反應(yīng)液及酶混合液，充分混勻成PCR-mix，瞬 時(shí)離心后備用。
[0044] 2?熒光PCR反應(yīng)
[0045] 1)將PCR反應(yīng)管放入熒光定量PCR擴(kuò)增儀，按對(duì)應(yīng)順序設(shè)置待測(cè)樣本名稱(chēng)；
[0046] 2)焚光檢測(cè)通道選擇：選擇FAM通道（Reportere:FAM, Quencher:None)檢測(cè)皰原 蟲(chóng)有無(wú)；參比焚光（Passive Reference)設(shè)置為R0X ;
[0047] 3)熒光定量PCR反應(yīng)條件為：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種瘧原蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括用于熒光定量PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)液。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸 擴(kuò)增的上游引物和下游引物序列，且 所述上游引物的序列為：5' -CGACTAGGTGITGGATGAAAGTGT-3' ； 所述下游引物的序列為：5' -CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3'。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核 苷酸檢測(cè)的探針序列， 且所述探針序列為：5' -ITCGAGGTGACTITTAGAITGCTTCCTTC-3'。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述探針的羧基端用熒光素標(biāo)記，并 對(duì)羥基端用猝滅基團(tuán)修飾，其中所述熒光素選自FAM、TET、JOE和HEX，所述猝滅基團(tuán)選自 BHQl、DABCYL、TAMRA、BHQ2 和BHQ3。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，所述熒光素為FAM，所述猝滅基團(tuán)為 BHQl0
6. 根據(jù)權(quán)利要求1~5中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還含有 40~200mmol/L的參比染料。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任意一項(xiàng)所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒中還包括酶 混合液和瘧原蟲(chóng)陰性對(duì)照，且所述酶混合液包含濃度為1~5U/y1的耐熱DNA聚合酶和濃 度為0. 05~0. 2U/y1的尿嘧啶DNA糖基化酶。
8. -種使用如權(quán)利要求1~7中任意一項(xiàng)所述的試劑盒進(jìn)行瘧原蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè) 的方法，其包括： 步驟K，將PCR反應(yīng)液與酶混合液混合后制成PCR混合液； 步驟L，將PCR混合液離心處理，然后將經(jīng)過(guò)離心處理的PCR混合液加入多個(gè)反應(yīng)管，并 向含有PCR混合液的反應(yīng)管中分別加入陰性對(duì)照或待測(cè)樣本核酸，制成PCR反應(yīng)樣品，蓋好 管蓋； 步驟M，在熒光定量PCR擴(kuò)增儀上進(jìn)行熒光PCR反應(yīng)，檢測(cè)并記錄樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)與閾 值線(xiàn)； 步驟N，根據(jù)樣品的擴(kuò)增曲線(xiàn)形狀、擴(kuò)增曲線(xiàn)與閾值線(xiàn)是否存在交點(diǎn)Ct，以及Ct值大小 進(jìn)行瘧原蟲(chóng)分析； 其中，在步驟K中，PCR反應(yīng)液的加入量為42~43y1/人份，酶混合液的加入量為1~ 2y1/人份。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，在步驟L中，每個(gè)反應(yīng)管中陰性對(duì)照或待 測(cè)樣本核酸的加入量為3~5y1。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種瘧原蟲(chóng)檢測(cè)試劑盒，所述試劑盒中包括用于熒光定量PCR檢測(cè)的PCR反應(yīng)液。具體地，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸擴(kuò)增的上游引物和下游引物序列，且上游引物：5’-CGACTAGGTGTTGGATGAAAGTGT-3’；下游引物：5’-CCAGAACCCAAAGACTTTGATTTC-3’。在一種【具體實(shí)施方式】中，所述PCR反應(yīng)液中包含用于靶多核苷酸檢測(cè)的探針序列，且探針序列為：5’-TTCGAGGTGACTTTTAGATTGCTTCCTTC-3’。本發(fā)明提供的試劑盒操作簡(jiǎn)便，靈敏度高，并可預(yù)防PCR產(chǎn)物污染，具有很好的特異性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，利用該試劑盒進(jìn)行瘧原蟲(chóng)熒光定量PCR檢測(cè)，可以確定血液樣本中瘧原蟲(chóng)的有無(wú)，可為靈敏、早期診斷是否被瘧原蟲(chóng)感染提供可靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-68, C12Q1-04, C12R1-90
【公開(kāi)號(hào)】CN104762379
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510141779
【發(fā)明人】戴立忠, 鄧中平, 付亞成
【申請(qǐng)人】湖南圣湘生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月8日
【申請(qǐng)日】2015年3月30日