白介素-13結(jié)合蛋白的制作方法
【專利說明】白介轟-13結(jié)合蛋白
[OOOU 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2007年9月7日的國際申請(qǐng)PCT/US2007/019660進(jìn)入中 國、申請(qǐng)?zhí)枮?00780033285. 7的題為"白介素-13結(jié)合蛋白"的發(fā)明專利申請(qǐng)的分案申請(qǐng)。
[0002] 相關(guān)申請(qǐng)的香叉參考
[0003] 本申請(qǐng)要求于2006年9月8日提交的US臨時(shí)申請(qǐng)60/843, 249的優(yōu)先權(quán)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0004] 本發(fā)明設(shè)及IL-13結(jié)合蛋白，且具體而言設(shè)及其在預(yù)防和/或治療包括哮喘、過 敏、C0PD、纖維化和癌癥在內(nèi)的各種疾病的用途。
[000引 共同研究協(xié)巧介紹
[0006]本申請(qǐng)的內(nèi)容服從ProteinDesi即L油S，Inc.與AbbottL油oratories于2005 年12月14日簽訂的共同研究協(xié)議，且設(shè)及IL-13的重組工程化抗體。
【背景技術(shù)】
[0007] 人類比-13是從活化T細(xì)胞克隆的17-kDa糖蛋白狂urawski與de化ies 1994ImmunolToday15 19-26)，且由Th2譜系的活化T細(xì)胞產(chǎn)生，盡管ThO和IlilCD4+T細(xì) 胞、CD8+T細(xì)胞和幾個(gè)例如肥大細(xì)胞的非-T細(xì)胞群體也產(chǎn)生比-13狂urawski和de化ies 1994ImmunolToday15 19-26)。比-13的功能包括在人類B細(xì)胞中轉(zhuǎn)變成I班(Punnonen， Aversa等人1993Proc化tlAcadSciUSA90 3730-4)且抑制人和小鼠炎性細(xì)胞因子 產(chǎn)生（deWaalMalefyt，F(xiàn)igdor等人，1993JImmunol151 6370-81 ;Dohe;rty，Kastelein 等人，1993JImmunol151 7151-60)的免疫球蛋白同種型。比-13與其細(xì)胞表面受體 IL-13RQ1和IL-13RQ2結(jié)合。IL-13RQ1W低親和力煙)約lOnM)與IL-13相互作用，接 著募集比-4RaW形成高親和力（邸約0. 4nM)信號(hào)傳導(dǎo)異二聚受體復(fù)合體（Aman，Tayebi 等人，1996JBiolChem271 29265-70 ;Hilton，aiang等人，1996Proc化tlAcadSciUS A93 497-501)。IL-4R/IL-13RQ1復(fù)合體在例如B細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨瞻細(xì)胞、樹狀細(xì)胞、 嗜伊紅性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、氣管上皮細(xì)胞和氣管平滑肌細(xì)胞的 許多細(xì)胞類型上表達(dá)（Gr油er，Gretener等人，1998EurJImmunol28 4286-98 ；Murata, Husain等人，1998IntImmunol10 1103-10 ;Akaiwa，化等人，2001 切tokine13 75-84)。 比-13RalAk4R受體復(fù)合體的結(jié)扎使得包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT6)和膜 島素受體底物-2QRS-2)途徑的各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑活化（Wang,Michieli等人，1995Blood 86421-27 ;Takeda，Kamanaka等人，1996JImmunol157 3220-2)。單獨(dú)的比-13Ra2 鏈 對(duì).比-13具有高親和力（KD約0. 25-0. 4nM)，且起反向調(diào)節(jié)比-13結(jié)合的誘巧受體的作用 (Donaldson,Whitters等人，1998JImmunol161 2317-24)和誘導(dǎo)巨瞻細(xì)胞和可能地其它 細(xì)胞類型中TGF-b經(jīng)由AP-1途徑合成和纖維化的信號(hào)傳導(dǎo)受體的作用（Fichtner-Feigl， Strober等人，SOOGP'JatMed12 99-106)。
[0008] 臨床前哮喘動(dòng)物模型中進(jìn)行的幾個(gè)研究指示IL-13在哮喘中起重要作用。該 些數(shù)據(jù)包括IL-13基因剔除小鼠的哮喘抗性W及各種小鼠模型中IL-13括抗劑（可溶 性IL-13受體、抗IL-13mAbs等）的哮喘表型抑制作用（Sela1999Harefu址137 317-9;Wills-Karp和Qiiaramonte2003QirrOpinPulmMed9 21-7;Wills-Karp2004Immunol Rev202 175-90)。多個(gè)研究已證明向小鼠和豚鼠的肺部藥理學(xué)施用重組IL-13誘導(dǎo)氣管 粘液高度分泌、嗜酸粒細(xì)胞增多和AHR(Grunig，Warnock等人，1998Science282 2261-3 ; Wills-Ka巧，Luyimbazi等人，1998Science282 2258-61 ;Kibe，Inoue等人，2003AmJ RespirGritCareMed167 50-6 ;Vargaftig和Singer2003AmJPhysiolLungCellMol Physiol28化260-9 ;Vargaftig和Singer2003AmJRespirCellMolBiol28 410-9)。 比-13的該些效應(yīng)在構(gòu)成型或誘導(dǎo)型表達(dá)比-13的轉(zhuǎn)基因小鼠系統(tǒng)中重新產(chǎn)生狂hu，化mer 等人，1999JClinInvest103 779-88;化U，Lee等人，2001AmJRespirGritCareMed 164S67-70;Lanone，aieng等人，2002JClinInvest110 463-74)。IL-13 的慢性轉(zhuǎn)基因過 度表達(dá)也誘導(dǎo)上皮下纖維化和氣腫。缺乏IL-13 (和IL-14)信號(hào)傳導(dǎo)分子STAT6的小鼠未 能發(fā)展過敏原誘導(dǎo)的AHR和粘液過度產(chǎn)生（Kuperman，化ang等人，2002化tMed8885-9)。 使用可溶性IL-13受體融合蛋白（sIL-13Ra2Fc)的研究已證明此細(xì)胞因子在實(shí)驗(yàn)性過敏 原卵白蛋白（OVA)誘導(dǎo)的氣管疾病中的關(guān)鍵作用（GrunigiWarnock等人，1998Science282 2261-3 ;Wills_Ka巧，Luyimbazi等人，1998Science282 2258-61 ;Taube，Duez等人，2002J Immunol169 6482-9)。也在鼠類哮喘慢性模型中證明了抗IL-13治療的效力。除表現(xiàn)出 粘液高度分泌和AHR的特征外，慢性哮喘的此模型證明了更急性模型中缺乏的幾個(gè)人類疾 病的特點(diǎn)。該些包括位于上皮間空間的肺組織嗜酸粒細(xì)胞增多W及如由膠原沉積增加所測(cè) 定的平滑肌纖維化。用OVA在OVA敏化小鼠中每周1次重復(fù)氣溶膠攻擊，歷時(shí)總計(jì)4周誘 導(dǎo)慢性哮喘模型。最后2周OVA攻擊中施用抗IL-13抗體（自第36天開始，在研究的第53 天評(píng)估效力讀出值）顯著地抑制了AHR，肺炎、杯狀細(xì)胞增生、粘液高度分泌和氣管纖維化 (Yang，Li等人，2005J化armacolExp化er)。此外，在靈長類哮喘模型中也證明比-13括 抗劑的治療作用抑制AHR[摘要，American"ThoracicSociety2005]。
[0009] 由于已在哮喘患者的肺檢測(cè)到升高含量的IL-13mRNA和蛋白，其與疾病的嚴(yán)重程 度相互有關(guān)，因此IL-13牽設(shè)于人類哮喘的發(fā)病機(jī)制中化uang，Xiao等人，1995JImmunol 155 2688-94)。另外，已鑒定出導(dǎo)致升高的IL-13水平的人類IL-13遺傳多態(tài)性，且其與哮 喘和特異反應(yīng)性皮炎相關(guān)化einzmann，Mao等人，2000HumMolGenet9 549-59 ;Hoerauf， Kruse等人，2002MicrobesInfect4 37-42;Vercelli2002QirrOpinAllergyClin Immunol2 389-93 ;Heinzmann，Jerkic等人，2003JAllergyClinImmunol112 735-9; Chen，Ericksen等人，2004JAllergyClinImmunol114 553-60 ;Vladich，Brazille等 人，2005JClinInvest),且在哮喘患者的肺中已檢測(cè)到升高的IL-13水平化uang，Xiao 等人，1995JImmunol155 2688-94 ;Arima，Umeshita-Suyama等人，2002JAllergyClin Immunol109 980-7 ;Be;rry，Parker等人，2004JAllergyClinImmunol114 1106-9)。由 于具有導(dǎo)致較高血漿IL-13水平的IL-13基因多態(tài)性的個(gè)體對(duì)于特異反應(yīng)性和哮喘具有 增加風(fēng)險(xiǎn)性，因此已也證明IL-13與哮喘之間的遺傳聯(lián)系（Wills-Ka巧2000RespirRes1 19-23)。
[0010] 由于人類比-13在各種人類病癥中的作用，因此治療策略已經(jīng)設(shè)計(jì)W抑制或抵消 比-13活性。尤其已尋找結(jié)合與中和IL-13的抗體作為抑制IL-13活性的手段。然而，在現(xiàn) 有技術(shù)中需要能夠結(jié)合IL-13的改善的抗體。優(yōu)選地，抗體結(jié)合人類IL-13。優(yōu)選地，抗體 能夠中和人類IL-13。本發(fā)明提供了新的結(jié)合蛋白、CDR移植抗體、人源化抗體和其片段的 家族，其能夠結(jié)合人類IL-13,W高親和力結(jié)合，W及結(jié)合且中和人類IL-13。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明設(shè)及IL-13結(jié)合蛋白。本發(fā)明的結(jié)合蛋白包括但不限于抗體、抗原結(jié)合部 分和其它能夠結(jié)合人類IL-13的抗原結(jié)合蛋白。另外，本發(fā)明提供了IL-13結(jié)合蛋白的制 備和使用方法。
[0012] 本發(fā)明的一個(gè)方面設(shè)及能夠結(jié)合IL-13的結(jié)合蛋白。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中， 結(jié)合蛋白結(jié)合人類IL-13。優(yōu)選地，所述結(jié)合蛋白能夠調(diào)節(jié)IL-13的生物學(xué)功能。所述結(jié)合 蛋白更優(yōu)選能夠中和IL-13。
[0013] 在本發(fā)明的一個(gè)方面中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-13,且阻止IL-13與IL-13Q1 受體結(jié)合。在本發(fā)明的另一個(gè)方面中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-13,且阻止IL-13與 比-13a2受體結(jié)合。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述結(jié)合蛋白能夠結(jié)合IL-13,且阻止 比-13與比-13a1受體和比-13a2結(jié)合。
[0014]本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了分離的抗體或其抗原結(jié)合片段，其中所述抗體或其 抗原結(jié)合片段結(jié)合人類IL-13,且在基于細(xì)胞表面的受體結(jié)合測(cè)定中W下述IQ。抑制所述 比-13 與比-13a2 受體結(jié)合，其中ICs。選自約 1. 5X10-8至 1X10-8m、1X10-8至 1X10-9m、 1(T9至1〇4°m和1(TW至lO^iM;或在基于ELISA的受體結(jié)合測(cè)定中W下述IC5。抑制所述 比-13 與比-13a2 受體結(jié)合，其中ICs。選自約 1.8X10-8至 1X10-8m、1X10-8至 1X10-9m、 1(T9至ICT^M和1(TW至ICrilM。優(yōu)選地，抗體結(jié)合人類IL-13且在基于細(xì)胞表面的受體結(jié)合 測(cè)定中W2. 7X10-9M的IQ。抑制所述IL-13與比-13a2受體結(jié)合，且在基于ELISA的受體 結(jié)合測(cè)定中W1. 1X1(T9M的ICw抑制所述IL-13與IL-13a2受體結(jié)合。優(yōu)選地抗體或其 抗原結(jié)合片段結(jié)合人類IL-13,且在基于細(xì)胞表面的受體結(jié)合測(cè)定或在基于ELISA的受體 結(jié)合測(cè)定中在lOOnM的濃度下將所述IL-13與IL-13a2受體的結(jié)合抑制約