Knickkopf基因dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及飛幢knic化opf(Knk)基因dsRNA在害蟲防治 中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前對于農(nóng)業(yè)害蟲的防治主要依靠化學(xué)殺蟲劑的施用。長期施用農(nóng)藥產(chǎn)生一系列 問題，害蟲對殺蟲劑的抗藥性增強(qiáng)，導(dǎo)致殺蟲劑劑量的加大，農(nóng)藥大量殘留加重對環(huán)境的污 染，最終危害人類的健康。因此，迫切需要開發(fā)環(huán)境友好型的生物殺蟲劑。
[0003] RNA干擾（RNAi)是指雙鏈RNA(double-strandedRNA，dsRNA)與同源mRNA特異 性結(jié)合而使其降解，從而導(dǎo)致基因沉默阻止基因的正常表達(dá)。RNAi技術(shù)于1998年在秀麗隱 桿線蟲（Caenorh油ditiselegans)中報(bào)道，2006年獲得諾貝爾獎。該技術(shù)兼具特異性和高 效性，是目前基因功能研究的重要手段，同時在作物害蟲防治方面展示了廣闊的應(yīng)用前景。 采用RNAi技術(shù)進(jìn)行害蟲控制具有殺蟲專一性高和無殘留等特點(diǎn)，已被公認(rèn)為"第四代殺蟲 劑"，是植物保護(hù)領(lǐng)域未來的重要發(fā)展方向之一。因此篩選高效致死昆蟲的特異性dsRNA分 子祀標(biāo)對于加速RNAi技術(shù)在害蟲防治中的應(yīng)用具有重要的意義。
[0004] 昆蟲表皮可W保護(hù)昆蟲免受外界機(jī)械性損傷和病原微生物的侵害，對昆蟲生長發(fā) 育起著重要的作用。Knk基因參與昆蟲表皮幾了質(zhì)的有序排列，該基因的沉默將導(dǎo)致表皮幾 了質(zhì)排列素亂，喪失表皮的正常功能而導(dǎo)致昆蟲晚皮阻滯而死亡。因此，本發(fā)明基于RNA干 擾技術(shù)，提供了一種對環(huán)境無毒無害、特異性強(qiáng)的新型害蟲防治分子祀標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種飛幢Knk基因和其合成的dsRNA，W及dsRNA在害蟲防 治中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明提供的一種飛幢Knk基因，該基因的核巧酸序列為SEQIDNO;1所示的序 列。核巧酸序列的獲得是將從飛幢轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中捜索獲得的片段通過GeneDoc軟件拼接 比對后，進(jìn)一步同時設(shè)計(jì)上游引物SEQIDN0;3和下游引物SEQIDN0;4,通過PCR擴(kuò)增獲 得，將純化后的PCR產(chǎn)物與PEASY-bluntzero載體同時轉(zhuǎn)入trans-Tl感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)， 挑取白斑后接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，后提取質(zhì)粒。將檢測含有目的條帶的菌液后送入公 司測序，測序獲得該基因的核巧酸長度為2074bp，其核巧酸序列為SEQIDN0;1。
[0007] 本發(fā)明提供的一種飛幢Knk基因編碼的氨基酸，其特征是序列SEQIDNO;2所示 的序列。該氨基酸序列獲得是采用Ex化Sy在線軟件將SEQIDNO;1翻譯為相應(yīng)的氨基酸 并對其蛋白特性進(jìn)行進(jìn)一步預(yù)測。結(jié)果表明Knk基因的編碼681個氨基酸，分子量為77KD， 理論等電點(diǎn)為5. 86。
[000引本發(fā)明提供的一種飛幢Knk基因片段及其合成的dsRNAW及在害蟲防治中的應(yīng) 用：基于飛幢Knk基因的核巧酸序列，采用引物設(shè)計(jì)軟件primerpremierS.O分別設(shè)計(jì)一 條均含有T7啟動子的上游引物SEQIDN0;5和下游引物SEQIDN0;6,經(jīng)過PCR擴(kuò)增獲得 一段長度為538bp的DM片段，其序列為SEQIDNO;7所示（兩端均含有T7啟動子）。收 集經(jīng)過試劑盒純化后的PCR產(chǎn)物并將其作為dsRNA合成的模板，依照T7化boMAX?Express RNAiSystem(Promega)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA，然后使用微量進(jìn)樣器將其注射進(jìn)入飛 幢體腔內(nèi)。對其mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測，同時觀察其表型。結(jié)果顯示注射飛幢Knk基因片段 合成的dsRNA后，其表達(dá)量顯著降低，同時飛幢出現(xiàn)晚皮困難最終死亡的表型。
[0009] 飛幢Knk基因片段合成的dsRNA對飛幢致死的原因研究；將注射dsGFP的蟲體設(shè) 為對照組，同時將注射Knk基因片段合成的dsRNA(dsKnk)的飛幢設(shè)為處理組。分別將dsGFP 和dsKnk注射進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)，將其表皮解剖下來進(jìn)行固定，采用透射電鏡方法揭示dsRNA 對飛幢的致死作用的原因。結(jié)果表明，與對照組相比，注射dsKnk的處理組蟲體的表皮的幾 了質(zhì)致密排列的層狀結(jié)構(gòu)消失。
[0010] 本發(fā)明的有益效果；飛幢注射Knk基因片段合成的dsRNA后，出現(xiàn)晚皮困難并致死 的現(xiàn)象，具體表現(xiàn)為背部脊線開裂，背部弓起，但蟲體難W從舊表晚出最終死亡。死亡率為 76%。本發(fā)明飛幢Knk基因片段合成的dsRNA對飛幢具有高的致死率，對于害蟲防治具有 重要的現(xiàn)實(shí)意義，可W為害蟲防治提供新的途徑。
【附圖說明】
[OCm] 圖1 ;飛幢Knk基因全長cDM的PCR擴(kuò)增檢測圖（M所示為化5000DNAMarker,從 下到上的條帶依次為 100、250、500、750、1000、1500,2000、3000、5000bp，l所示為飛幢Knk 基因）
[001引 圖2;SEQIDNO;7合成的dsRNA進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)2化后，飛幢Knk基因的mRNA表 達(dá)圖（1為注射dsGFP的對照組，2為注射dsRNA的處理組）。0 -actin為內(nèi)參基因。其中 沖<0. 05, *沖<0. 01。
[001引圖3;SEQIDNO;7合成的dsRNA對飛幢5齡若蟲晚皮的影響（1為注射dsGFP的 對照組，2和3均為注射dsRNA的處理組）。實(shí)驗(yàn)組飛幢出現(xiàn)晚皮困難并死亡的表型。
[0014] 圖4 ;dsRNA對表皮幾了質(zhì)超微結(jié)構(gòu)影響。實(shí)驗(yàn)組飛幢幾了質(zhì)致密的層狀結(jié)構(gòu)消 失。
【具體實(shí)施方式】
[0015] 實(shí)施例1 ;飛幢Knk基因全長cDNA獲得W及氨基酸預(yù)測
[0016] 1.飛幢Knk基因片段捜索
[0017] 從飛幢的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行化igene捜索，后采用NCBIBlastx在線軟件進(jìn)行 分析，確定獲得1條飛幢Knk基因片段。
[0018] 2.飛幢Knk基因全長cDNA獲得
[0019] 1)PCR擴(kuò)增所需引物設(shè)計(jì)：
[0020] 采用GeneDoc軟件對捜索獲得的飛幢Knk基因片段進(jìn)行拼接比對，并采用primer premiers. 0 軟件分別設(shè)計(jì)上游引物AAGAAATGCACGAATTAGCAATATG(SEQIDN0;3)和下游引 物TTAACACTAATTTTGCATCACAGTCC(SEQIDN0;4)。將設(shè)計(jì)好的引物送往上海英濰捷基生物 有限公司合成。
[0021] 2)PCR擴(kuò)增所需模板制備：
[0022] 選取大小一致、生長狀況良好的飛幢5齡若蟲，在體式顯微鏡下將其表皮快速剝 離，并迅速保存于液氮中。參照TaKaRaTrizol試劑盒提取RNA。采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶將所 提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。從而獲得PCR反應(yīng)所需模板。
[0023] 3)PCR擴(kuò)增反應(yīng)
[0024] PCR擴(kuò)增獲得飛幢Knk基因全長cDNA通過瓊脂糖凝膠進(jìn)行檢測（圖1)。擴(kuò)增獲 得的？〔1?產(chǎn)物通過661￡義化03(31：；[0]11(；[1：(01116肖3)純化后與陽45￥-13111]11261'0(全式金公 司）載體同時轉(zhuǎn)入