Trans-Tl感受態(tài)細(xì)胞中培養(yǎng)，挑取白斑并接入LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，采 用PlasmidMiniKitl(Omega)提取質(zhì)粒。將檢測含有目的條帶的菌液送入上海英濰捷基 生物有限公司進(jìn)行測序，測序獲得該基因全長cDNA的核巧酸長度為2074bp，其核巧酸序列 為SEQIDNO;1所示的序列。
[0025] 3.飛幢Knk基因氨基酸預(yù)測
[0026] 采用Ex化Sy在線軟件對飛幢Knk基因編碼氨基酸進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果表明飛幢Knk基 因編碼681個氨基酸，其氨基酸序列為SEQIDNO;2所示的序列。分子量為77KD，等電點為 5. 86。采用NCBI的Blast軟件對其功能域進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果顯示飛幢Knk基因具有信號膚， 2個串聯(lián)的的DM13結(jié)構(gòu)域和1個多己胺類似域W及C末端的GPI-錯定位點。飛幢Knk基 因編碼的氨基酸與果蛹Knk編碼氨基酸序列同源度達(dá)到63 %。
[0027] 實施例2 ;飛幢Knk基因片段合成的dsRNA
[002引 1.飛幢Knk基因片段dsRNA合成所需引物
[0029] 基于測序獲得飛幢Knk基因的核巧酸序列SEQIDNO;1，采用primerpremiers. 0 軟件設(shè)計一對合成dsRNA所需引物。序列taatacgactcactatagggAACATCACGGCTCAGTCT CC(SEQIDN0;5)和taatacgactcactatagggGGGAACCAAGTAGCCATTGA(SEQIDN0;6)所示分 別為上下游引物。（斜體部分為T7啟動子）。將設(shè)計好的引物送往上海英濰捷基生物有限 公司合成。
[0030] 2.飛幢Knk基因片段dsRNA合成所需模板制備
[003U 將設(shè)計合成的用于合成dsRNA的所需引物（均含有T7啟動子序列）進(jìn)行PCR擴 增，獲得一段長度為538bp的片段。其核巧酸序列為SEQIDNO;7所示的序列。經(jīng)過Gel ExtractionKit(Omega)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化后使用NaNoDrop2000(Thermoscientific) 對其濃度進(jìn)行檢測，使其終濃度達(dá)到2yg/8y1。W此作為dsRNA合成的模板。
[003引 3.飛幢Knk基因片段dsRNA的合成
[0033] 基于上述制備得到的用于合成dsRNA的模板，采用T7化boMAX?ExpressRNAi System(Promega)試劑盒體外轉(zhuǎn)錄合成dsRNA。使用NaNoDrop2000(Thermoscientific) 對其進(jìn)行定量，最終使其濃度達(dá)到2. 5yg/y1，并將其保存于-80°C超級低溫冰箱中。
[0034] 實施例3 ;飛幢Knk基因片段合成dsRNA對飛幢的致死實驗
[0035] 1.飛幢Knk基因片段合成dsRNA的注射
[0036] 挑取25頭生長狀況良好、大小一致、雌雄各半的5齡2天若蟲用于dsRNA注射所 需。將注射dsGFP的蟲體設(shè)為對照組，同時將knk基因片段合成的dsRNA(dsKnk)設(shè)立為實 驗組。采用微量注射器將2. 5y1 (6. 25yg)的dsKnk輕輕順著飛幢腹部收縮的方向輕輕注 射進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)。同時挑取相同數(shù)量的健康若蟲注射相同量的dsGFP。待注射完畢后，將 兩組若蟲置于相同條件下（光照：黑暗時間=1化：l〇h，溫度30±2°C，濕度60%)。飼喂足 量的新鮮麥苗和麥款。
[0037] 2.飛幢Knk基因片段mRNA表達(dá)檢測
[003引待合成的dsRNA注射進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)2化后，分別從實驗組和對照組中選取9頭 5齡若蟲，快速凍于液氮中。采用TaKaRaTrizol試劑盒提取RNA。并采用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶 將所提RNA反轉(zhuǎn)錄成第一鏈cDNA。采用Real-timePCR方法分別檢測目的基因（LmKnk)和 管家基因（e-actin)的mRNA表達(dá)，從而對其沉默效率進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，與對照組 比較，實驗組中目的基因Knk的mRNA表達(dá)顯著降低（圖2)。兩組均設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)， 其中每個生物學(xué)重復(fù)含有3頭若蟲。
[0039] 3.合成Knk基因片段的dsRNA后對五齡若蟲晚皮的影響
[0040] 注射dsGFP的對照組在5齡7天全部成功晚去舊表皮，且晚皮成功的成蟲均可W 健康生長。注射dsKnk的實驗組若蟲同樣在第7天出現(xiàn)晚皮現(xiàn)象，但難W晚去舊表皮到達(dá) 成蟲，最終導(dǎo)致死亡（圖3)，死亡率達(dá)到76%。
[004U實施例4 ;飛幢Knk基因片段合成dsRNA對飛幢表皮結(jié)構(gòu)的影響
[0042] Knk基因片段合成的dsRNA對飛幢表皮超微結(jié)構(gòu)的影響
[0043] 將合成的dsGFP和dsKnk分別注射進(jìn)入飛幢體腔內(nèi)，將飛幢第S腹節(jié)的表皮快速 解剖下來并將其固定在2%戊二醒中。經(jīng)緩沖液漂洗后，進(jìn)一步固定在1%餓酸中，采用環(huán) 氧樹脂包埋，超薄切片，雙染色后，進(jìn)行超微觀察。超微結(jié)構(gòu)顯示，與對照相比，處理組飛幢 表皮的幾了質(zhì)致密排列的層狀結(jié)構(gòu)消失（圖4)。
【主權(quán)項】
1. 一種飛幢knickkopf基因，其特征在于核苷酸序列為SEQIDNO:1。
2. 如權(quán)利要求1所述的飛蝗knickkopf?基因編碼的氨基酸，其特征在于氨基酸序列為 SEQIDNO:2。
3. -種飛蝗knickkopf基因片段，其特征在于核苷酸序列為SEQIDNO:7。
4. 如權(quán)利要求3所述的一種飛蝗knickkopf基因片段的獲得方法，其特征在于包括如 下步驟：基于knickkopf基因，設(shè)計含有17啟動子的上游引物SEQIDNO:5和下游引物SEQ IDNO:6,通過PCR擴增獲得。
5. 如權(quán)利要求3所述飛幢knickkopf基因片段合成的dsRNA。
6. -種飛幢knickkopf基因片段的dsRNA的合成方法，其特征在于包括如下步驟：將 核苷酸序列為SEQIDNO:7的基因片段的PCR產(chǎn)物純化后，按照HRiboMAX?ExpressRNAi System(Promega)試劑盒說明體外轉(zhuǎn)錄合成得到dsRNA。
7. 如權(quán)利要求5所述飛幢knickkopf基因片段合成的dsRNA在飛幢防治中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明提供一種Knickkopf基因dsRNA在害蟲防治中的應(yīng)用。具體是一種飛蝗Knickkopf基因，該基因的核苷酸序列為SEQ ID NO：1，基于SEQ ID NO：1，設(shè)計并合成基因片段和相應(yīng)的dsRNA。設(shè)計合成的dsRNA注射進(jìn)入飛蝗體內(nèi)，可以使飛蝗出現(xiàn)蛻皮困難，導(dǎo)致死亡。死亡率達(dá)到76％。本發(fā)明篩選獲得的Knickkopf基因可作為害蟲防治的分子靶標(biāo)，為害蟲有效控制提供新的途徑。
【IPC分類】C12N15-12, A01P7-04, C12N15-10, A01N63-02, C07K14-435
【公開號】CN104774843
【申請?zhí)枴緾N201510160191
【發(fā)明人】張建珍, 于榮榮, 李濤, 丁國偉, 馬恩波
【申請人】山西大學(xué)
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月7日