人成纖維細(xì)胞的分化的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】人成纖維細(xì)胞的分化
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2012年11月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)61/727, 025的權(quán)益， 所述美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?jiān)诖送ㄟ^(guò)引用以其整體（包括所有表、圖和權(quán)利要求）并入。 發(fā)明領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明一般涉及成體干細(xì)胞，更具體地涉及用于允許人成纖維細(xì)胞獲得間充質(zhì)細(xì) 胞（MSC)樣狀態(tài)的方法和誘導(dǎo)MSC潛能人成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞 的方法以及使用其的方法。本發(fā)明一般涉及細(xì)胞外基質(zhì)的建立和增強(qiáng)的沉積。
[0004] 發(fā)明背景
[0005]干細(xì)胞是在多細(xì)胞生物體中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞，其可分化成不同的特化細(xì)胞類(lèi)型或自我 更新，以產(chǎn)生更多干細(xì)胞。干細(xì)胞與其它細(xì)胞類(lèi)型區(qū)別在于兩個(gè)重要特征。首先，它們是能 夠，有時(shí)在長(zhǎng)期不活動(dòng)后，通過(guò)細(xì)胞分裂自我更新的非特化細(xì)胞。第二，在某些生理或?qū)嶒?yàn) 條件下，它們可被誘導(dǎo)成為具有特殊功能的組織或器官特異性細(xì)胞。在某些器官諸如腸道 和骨髓中，干細(xì)胞定期分裂以修復(fù)和替換磨損或損壞的組織。然而，在其他器官，諸如胰腺 和心臟中，干細(xì)胞只在特殊條件下分裂。
[0006] -種類(lèi)型的干細(xì)胞是體細(xì)胞（成體）干細(xì)胞。成體干細(xì)胞是大許多器官和分化的 組織中發(fā)現(xiàn)的對(duì)于自我更新和分化具有有限能力的相對(duì)罕見(jiàn)的未分化細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞在它 們的分化能力上可變化，但它通常限于來(lái)源器官中的細(xì)胞類(lèi)型。
[0007]干細(xì)胞在健康和醫(yī)學(xué)研宄的許多不同領(lǐng)域中具有潛力。一些最嚴(yán)重的醫(yī)學(xué)病癥， 諸如癌癥和出生缺陷，是由于當(dāng)細(xì)胞經(jīng)歷轉(zhuǎn)化時(shí)出現(xiàn)的問(wèn)題而引起的。理解正常細(xì)胞的發(fā) 育和分化機(jī)制將允許更好地理解這些病癥。
[0008]干細(xì)胞的另一個(gè)潛在應(yīng)用是使細(xì)胞和組織用于醫(yī)學(xué)治療。今天，捐贈(zèng)器官和組織 經(jīng)常被用來(lái)取代患病或損壞的那些器官和組織。不幸的是，需要移植的人的數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò) 可用于移植的器官數(shù)量。因細(xì)胞來(lái)源于患者而與患者組織匹配的成體干細(xì)胞，提供了治療 許多疾病、病癥和失能（包括帕金森病、肌萎縮側(cè)硬化、脊髓損傷，燒傷、心臟病、糖尿病和 關(guān)節(jié)炎）的替代細(xì)胞和組織的可再生來(lái)源的可能性。
[0009]成纖維細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)（動(dòng)物組織的結(jié)構(gòu)框架（基質(zhì)））并在傷口愈合中 起著至關(guān)重要的作用的一種類(lèi)型的細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)的組成決定了結(jié)締組織的物理性質(zhì)。 成纖維細(xì)胞產(chǎn)生各種膠原、糖胺聚糖、網(wǎng)狀和彈性纖維以及糖蛋白。成纖維細(xì)胞是在動(dòng)物結(jié) 締組織中最常見(jiàn)的細(xì)胞，并且從原始間充質(zhì)細(xì)胞衍生而來(lái)。組織損傷刺激細(xì)胞因子和生長(zhǎng) 因子從細(xì)胞外基質(zhì)釋放并且誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的有絲分裂。
[0010] 成纖維細(xì)胞通常被視為終末分化的細(xì)胞類(lèi)型。它們具有有限的增殖能力，并且不 產(chǎn)生其它類(lèi)型的細(xì)胞。然而，一些證據(jù)表明，成纖維細(xì)胞可以能夠分化成其它細(xì)胞類(lèi)型，因 此有資格作為真正的成體干細(xì)胞。永生化鼠細(xì)胞系3T3L1因其分化成脂肪細(xì)胞的能力而被 廣泛地用于研宄。該細(xì)胞系衍生自小鼠胚胎成纖維細(xì)胞。為了誘導(dǎo)脂肪生成，標(biāo)準(zhǔn)方案要求 將細(xì)胞涂板在纖連蛋白上，達(dá)到匯合，并用胰島素、地塞米松、抗壞血酸、吲哚美辛（C0X1抑 制劑）和羅格列酮（PPAR-Y交聯(lián)劑）的組合進(jìn)行處理。通常假定3T3L1細(xì)胞變成脂肪細(xì) 胞的能力是細(xì)胞系的胚胎來(lái)源、物種和永生化的結(jié)果，這可賦予一定水平的表型的可塑性。 偶爾地，觀察到可具有少數(shù)脂滴的隨機(jī)胚胎成纖維細(xì)胞。該觀察加上文獻(xiàn)中的證據(jù)表明，許 多細(xì)胞類(lèi)型保留少量多能干細(xì)胞，諸如肝母細(xì)胞，其可被引導(dǎo)至超過(guò)一個(gè)發(fā)育途徑，并且一 些癌癥據(jù)認(rèn)為由已保留無(wú)限增殖的能力然而不能分化的細(xì)胞產(chǎn)生。已發(fā)展了這樣的假說(shuō)， 即如果給予對(duì)于期望的細(xì)胞類(lèi)型是特異性的適當(dāng)信號(hào)，所謂的"終末"分化細(xì)胞可順從于它 們的細(xì)胞命運(yùn)的改變，從而表現(xiàn)先前未認(rèn)識(shí)到有限的效力。已確定如果以與3T3L1永生化 細(xì)胞系相似的方式處理，一個(gè)亞組的原代鼠胚胎成纖維細(xì)胞（約20% )和雞胚胎成纖維細(xì) 胞（約5% )，但無(wú)大鼠胚胎成纖維細(xì)胞，還能分化成脂肪細(xì)胞。然而，人成纖維細(xì)胞，盡管作 為與3T3L1細(xì)胞相似的細(xì)胞類(lèi)型，但卻是不同的物種，來(lái)自從不同的組織來(lái)源，并且不是永 生化的或胚胎的，從而不一定符合人成纖維細(xì)胞可以變成脂肪細(xì)胞的期望。因此，誘導(dǎo)人成 纖維細(xì)胞以獲得MSC樣狀態(tài)和這些細(xì)胞至脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化是必要的。
[0011] 細(xì)胞外基質(zhì)是由細(xì)胞分泌的提供抗張強(qiáng)度、抗壓性、三維組織信號(hào)和貯存生長(zhǎng)因 子和細(xì)胞因子的場(chǎng)所的物質(zhì)。大體解剖學(xué)水平上的細(xì)胞外基質(zhì)的實(shí)例是愈合傷口、肌腱、韌 帶、骨、軟骨、血管、角膜、牙齒、頭發(fā)和皮膚。細(xì)胞外基質(zhì)的亞成分是各種各樣的角蛋白、膠 原蛋白、彈性蛋白、巢蛋白、鈣磷灰石、牙本質(zhì)、玻連蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白、蛋白聚糖、 基底膜和不太確定的結(jié)締組織。
[0012] 蛋白聚糖提供多種功能。它們?cè)试S水保留組織中，結(jié)合生長(zhǎng)因子、蛋白酶抑制劑和 酶，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，并通過(guò)結(jié)合于細(xì)胞外蛋白質(zhì)幫助組織基質(zhì)本身。附聯(lián)于蛋白聚糖的糖 (或碳水化合物）鏈被稱(chēng)為糖胺聚糖（GAG，也稱(chēng)為粘多糖）。所述GAG本身相對(duì)于它們的蛋 白質(zhì)主鏈?zhǔn)菢O其龐大的。聚集蛋白聚糖，最龐大的蛋白質(zhì)之一，由90%的糖鏈組成。
[0013] 歷史上，普通組織培養(yǎng)實(shí)踐在細(xì)胞培養(yǎng)期間的任何階段建立細(xì)胞外基質(zhì)。大多數(shù) 細(xì)胞和細(xì)胞系在被傳代至新鮮的板之前將在平板上生活2-5天。任何給定的細(xì)胞持續(xù)分泌 細(xì)胞外基質(zhì)，但在標(biāo)準(zhǔn)組織培養(yǎng)條件下是特別不想要的，因?yàn)榛|(zhì)本身會(huì)在產(chǎn)生對(duì)于良好 組織培養(yǎng)實(shí)踐和甚至細(xì)胞在板上的分配所必需的單細(xì)胞懸浮液中帶來(lái)問(wèn)題。細(xì)胞可因此而 停止增殖，進(jìn)入靜止?fàn)顟B(tài)。這樣的結(jié)果與大多數(shù)研宄者的要求（即可用于實(shí)驗(yàn)的快速分裂 群體）直接相反。
[0014] 當(dāng)需要將細(xì)胞外基質(zhì)用于組織培養(yǎng)時(shí)，可用重組或純化的蛋白質(zhì)諸如膠原、玻連 蛋白或纖連蛋白涂覆板。或者，可將細(xì)胞與已知建造對(duì)于細(xì)胞功能是必需的細(xì)胞外基質(zhì) (雖然所述基質(zhì)遠(yuǎn)未被充分確定）的另一種細(xì)胞類(lèi)型共培養(yǎng)。在這兩種情況下，研宄人員仍 然在尋求細(xì)胞的增殖，而非產(chǎn)生的細(xì)胞外基質(zhì)可賦予的任何功能。
[0015] 對(duì)于組織工程，需要細(xì)胞外基質(zhì)的存在。組織工程相對(duì)于組織培養(yǎng)是相對(duì)新的現(xiàn) 象，與組織培養(yǎng)不同，組織工程利用合成物質(zhì)或純化的基質(zhì)蛋白與隨后接種至支架上的細(xì) 胞的組合。組織工程需要細(xì)胞來(lái)建立細(xì)胞外基質(zhì)以當(dāng)在體內(nèi)移植時(shí)形成大體組織。然而如 上文中概述的，當(dāng)前的細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)不允許細(xì)胞在細(xì)胞外基質(zhì)上生長(zhǎng)。
[0016] 存在對(duì)產(chǎn)生在其上生長(zhǎng)細(xì)胞，用于組織工程以及傷口愈合的細(xì)胞外基質(zhì)的方法的 需要。
[0017] 發(fā)明簡(jiǎn)述
[0018] 本發(fā)明部分基于使得成纖維細(xì)胞能夠獲得具有潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞狀態(tài)的方法。 此外，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的試劑和試劑 盒。此外，本發(fā)明還提供了使用特殊糖增強(qiáng)細(xì)胞外基質(zhì)沉積的方法。
[0019] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞，從而 誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)條件下于成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（例如，F(xiàn)ibroLife S2培養(yǎng)基，Lifeline Cell Technology, Walkersvilie, MD)中生長(zhǎng)至匯合；在第一分細(xì)胞化培養(yǎng)基（例如， AdipoLife Complete DifFactor 1培養(yǎng)基）中培養(yǎng)細(xì)胞約4天；在第二分化培養(yǎng)基（例如， AdipoLife Complete DifFactor 2培養(yǎng)基）細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞17天；和確認(rèn)脂肪細(xì) 胞存在的方法。
[0020] 在優(yōu)選的方面，將成纖維細(xì)胞在FibroLife S2細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)至匯合。隨后將 成纖維細(xì)胞在AdipoLife Complete DifFactor 1細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)約4天。隨后將細(xì)胞 在AdipoLife Complete DifFactor 2細(xì)胞培養(yǎng)基中生長(zhǎng)17天。在一個(gè)方面，使用Oil Red 0品系檢測(cè)積累的脂滴（脂肪細(xì)胞的主要特征）來(lái)確認(rèn)脂肪細(xì)胞的存在。
[0021] 在一個(gè)方面，AdipoLife基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基包括Dermalif培養(yǎng)基（Lifeline Cell Technology