Life細(xì)胞培養(yǎng)基中生長3 周。在一個方面，使用阿新藍(lán)染色劑（Alcian Blue stain)檢測硫酸化蛋白聚糖（軟骨細(xì) 分泌軟骨的主要特征）來確認(rèn)軟骨細(xì)胞的存在。
[0037] 在一個方面，ChondroLife軟骨發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)基包括FibroLife ;葡萄糖0? l-10g/ L ;Plasmanate 1-25 % ;谷氨酰胺 l-100mM ;地塞米松 0? 1-100 y M ;胰島素 0? 1-20 y g/ml ; PS-轉(zhuǎn)鐵蛋白 0? 1-20 y g/ml ;EGF 0? l-20ng/ml ;抗壞血酸-2-磷酸酯 10-1000 y g/ml ;L-脯 氨酸 10-1000 y g/ml ;TGF0 3 0? l_20ng/ml ;葡糖醛酸 1-100 y g/ml ;半乳糖 0? 01_50g/L ; 硫酸氨基葡萄糖1-100 u g/ml ;和透明質(zhì)酸1-100 y g/ml。
[0038] 在優(yōu)選的方面，ChondroLife軟骨發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)基包括FibroLife;葡萄糖4. 5g/ L ;Plasmanate 2% ;谷氨酰胺6mM ;地塞米松0? 1 yM ;胰島素5 y g/ml ;PS_轉(zhuǎn)鐵蛋白5 y g/ ml ;EGF 5ng/ml ;抗壞血酸-2-磷酸醋 50 y g/ml ;L-脯氨酸 40 y g/ml ;TGF |3 3 2ng/ml ;葡 糖醛酸3. 24 y g/ml ;半乳糖2g/L ;硫酸氨基葡萄糖10 y g/ml ;和透明質(zhì)酸10 y g/ml。
[0039] 在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過方法產(chǎn)生的軟骨細(xì)胞，所述方法包 括：在標(biāo)準(zhǔn)條件下將成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（FibroLife S2培養(yǎng)基，Lifeline 〇61116。1111〇1(^7，1311^18￥；[116，]\?)中生長至8〇-90%匯合；沉淀細(xì)胞；將細(xì)胞重懸 浮于1. 5 %藻酸鹽溶液；使用注射器將藻酸鹽細(xì)胞溶液添加至10 OmM氯化鈣以形成 微珠；將微珠中的細(xì)胞在軟骨發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)基（ChondroLife培養(yǎng)基，Lifeline Cell Technology, Walkersvilie, MD)中培養(yǎng)3周；和確認(rèn)軟骨細(xì)胞的存在。
[0040] 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，通過方法產(chǎn)生軟骨細(xì)胞，所述方法包括將成纖維細(xì)胞在 FibroLife S2細(xì)胞培養(yǎng)基生長至80-90%匯合。隨后沉淀細(xì)胞，將其重懸浮于1. 5%藻酸鹽 溶液中。隨后使用注射器將藻酸鹽細(xì)胞溶液添加至l〇〇mM氯化鈣以形成微珠。隨后將微珠 中的細(xì)胞在ChondroLife細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)3周。在一個方面，使用阿新藍(lán)染色劑檢測硫 酸化蛋白聚糖（軟骨細(xì)分泌軟骨的主要特征）來確認(rèn)軟骨細(xì)胞的存在。
[0041] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的試劑盒， 所述試劑盒包括AdipoLife基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)基；DifFactor 1補(bǔ)充劑；DifFactor 2細(xì)胞補(bǔ)充 劑；油紅0染色劑；和用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的說明書。
[0042] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成骨細(xì)胞的試劑盒，其 包括OsteoLife完全細(xì)胞培養(yǎng)基；茜素紅染色劑；和用于將成纖維細(xì)胞分化成骨細(xì)胞的說 明書。
[0043] 在其它實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的試劑盒， 其包括：100mM氯化鈣溶液；ChondroLife軟骨發(fā)生細(xì)胞培養(yǎng)基；阿新藍(lán)染色劑；和用于將 成纖維細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞的說明書。
[0044] 在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過在至少一種復(fù)合糖存在的情況下培養(yǎng)細(xì)胞 來生成細(xì)胞外基質(zhì)的方法。在一個方面，所述復(fù)合糖可以是，但不限于，透明質(zhì)酸、甘露糖、 唾液酸、硫酸軟骨素、半乳糖、葡糖醛酸和硫酸氨基葡萄糖。在另一個方面，所述細(xì)胞是從間 充質(zhì)干細(xì)胞衍生的脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。在其它方面，所述細(xì)胞可以是，但不限于， 從成纖維細(xì)胞衍生的脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞。在另外的方面，所述細(xì)胞可以是，但不 限于，骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、血管或傷口愈合細(xì)胞。
[0045] 發(fā)明詳述
[0046] 本發(fā)明部分基于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的方法。因此， 本發(fā)明提供用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞、骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的試劑和試劑盒。
[0047] 在描述本發(fā)明的組合物和方法之前，應(yīng)理解本發(fā)明不限于描述的特定組合物、方 法和實(shí)驗(yàn)條件，這樣組合物、方法和條件可變化。還應(yīng)理解，本文中使用的術(shù)語僅為了描述 特定實(shí)施方案，并且無意是限制性的，因?yàn)楸景l(fā)明的方法僅在所附權(quán)利要求中受到限制。 [0048]如本說明書和所述權(quán)利要求中使用的，除非上下文中明確地另有所指，否則單數(shù) 形式"一種/ 一個（a) "、"一種/ 一個（an) "和"該（the) "包括復(fù)數(shù)指示物。因此，例如，對 "所述方法"的稱謂包括本文中所述類型的一種或多種方法和/或步驟，在閱讀本公開內(nèi)容 后，它們將對本領(lǐng)域普通技術(shù)人員變得顯而易見。
[0049]除非另外定義，否則本文中使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中 普通技術(shù)人員通常理解的含義相同的含義。雖然與本文中描述的那些方法和材料相似或等 同的任何方法和材料可用于本發(fā)明的實(shí)施和測試，但現(xiàn)在描述優(yōu)選方法和材料。
[0050]成纖維細(xì)胞是合成細(xì)胞外基質(zhì)（動物組織的結(jié)構(gòu)框架（基質(zhì)））并在傷口愈合中 起著至關(guān)重要作用的一種類型的細(xì)胞。細(xì)胞外基質(zhì)的組成決定了結(jié)締組織的物理性質(zhì)。成 纖維細(xì)胞產(chǎn)生各種膠原、糖胺聚糖、網(wǎng)狀和彈性纖維以及糖蛋白。它們是在動物結(jié)締組織中 最常見的細(xì)胞，并且從原始間充質(zhì)細(xì)胞衍生而來。組織損傷刺激細(xì)胞因子和生長因子從細(xì) 胞外基質(zhì)釋放并且誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的有絲分裂。
[0051]間充質(zhì)干細(xì)胞或MSC是能夠分化成多種細(xì)胞類型的多能干細(xì)胞。已顯示MSC在 體外或體內(nèi)分化成的細(xì)胞類型包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和如最近所描述 的，胰島細(xì)胞。MSC具有極大的自我更新能力，同時保持其多能性。
[0052] 骨細(xì)胞是負(fù)責(zé)骨形成的單核細(xì)胞；在本質(zhì)上，成骨細(xì)胞是除了成纖維細(xì)胞產(chǎn)物外 還表達(dá)骨涎蛋白和骨鈣蛋白的特化的成纖維細(xì)胞。
[0053]骨細(xì)胞產(chǎn)生類骨質(zhì)的基質(zhì)，其主要由I型膠原組成。成骨細(xì)胞也負(fù)責(zé)該基質(zhì)的礦 化。鋅、銅、鈣和鈉是該過程中所需的一些礦物質(zhì)。骨骼是不斷地受負(fù)責(zé)基質(zhì)和礦物質(zhì)的產(chǎn) 生的成骨細(xì)胞以及改造組織的破骨細(xì)胞重塑的動態(tài)組織。骨細(xì)胞傾向于隨年齡增加而減 少，從而影響骨組織的形成和骨吸收的平衡。
[0054] 脂肪細(xì)胞，也稱為脂細(xì)胞或脂肪細(xì)胞（fat cell)，是主要構(gòu)成脂肪組織，專門合成 脂質(zhì)和將其作為能量源貯存的細(xì)胞。脂肪細(xì)胞在維持適當(dāng)?shù)哪芰科胶?，響?yīng)于激素刺激動 員能量源，和通過信號分泌物控制變化中對于身體是非常重要的。在顯微鏡下，脂肪細(xì)胞顯 現(xiàn)臃腫的脂質(zhì)。細(xì)胞的細(xì)胞核被移至一側(cè)并且細(xì)胞的質(zhì)膜看起來象圍繞脂肪池的細(xì)線。
[0055] 軟骨細(xì)胞是僅在軟骨中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞。它們產(chǎn)生并維持軟骨基質(zhì)，所述基質(zhì)主要由 膠原和蛋白聚糖組成。取決于軟骨的類型和它們被發(fā)現(xiàn)時所在的組織，軟骨細(xì)胞在軟骨內(nèi) 的組織不同。
[0056]因此，在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于將成纖維細(xì)胞分化成脂肪細(xì)胞的 方法，所述方法包括在標(biāo)準(zhǔn)條件下將成纖維細(xì)胞在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基（例如，F(xiàn)ibroLife S2, Lifeline Cell Technology, Walkersville, MD)中生長至匯合；將細(xì)胞在第一分化細(xì)胞 培養(yǎng)基（例如，AdipoLife Complete DifFactor 1)中生長約4天；將細(xì)胞在第二分化細(xì)胞 培養(yǎng)基（例如，AdipoLife Complete DifFactor 2)中生長17天；和確認(rèn)脂肪細(xì)胞的存在。 [0057] 在優(yōu)選的方面，將成纖維細(xì)胞在FibroLife S2細(xì)胞培養(yǎng)基（表1)中生長至匯 合。隨后將細(xì)胞在AdipoLife Complete DifFactor 1細(xì)胞培養(yǎng)基（AdipoLife基礎(chǔ)培養(yǎng)基 (表3)+DifFactor 1補(bǔ)充劑（表4))中生長約4