高效表達(dá)腺病毒的細(xì)胞、及制備腺病毒的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及高效表達(dá)腺病毒的細(xì)胞、及制備腺病毒的方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腺病毒是一種無(wú)外殼的雙鏈DNA病毒，基因組長(zhǎng)約36kb，衣殼呈規(guī)則的20面體結(jié) 構(gòu)。腺病毒家族（Adenoviridae)的成員可感染種類相當(dāng)廣泛的有絲分裂后細(xì)胞，甚至包括 來自高度分化的組織中的細(xì)胞，例如骨骼肌細(xì)胞，肺細(xì)胞，腦細(xì)胞和心臟細(xì)胞。因?yàn)橄俨《?可將自身的基因組遞送到細(xì)胞核中，宿主范圍廣、可感染分裂和非分裂細(xì)胞、外源基因裝載 容量大等優(yōu)點(diǎn)，所以腺病毒成為表達(dá)和傳遞治療基因的主要候選者，已廣泛地被應(yīng)用于基 礎(chǔ)研宄和臨床試驗(yàn)中。
[0003] 病毒載體作為新一代的轉(zhuǎn)基因載體，在生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)各環(huán)節(jié)都有廣泛的應(yīng)用前 景，具體表現(xiàn)在：
[0004] (1)病毒載體是研宄基因功能的必備工具。
[0005] (2)病毒載體是基因靶向治療的利器。
[0006] (3)病毒載體是藥物研發(fā)和篩選方案實(shí)施的強(qiáng)有力助力器。
[0007] 雖然有著廣闊的應(yīng)用前景，但由于其技術(shù)難度大，成本高，時(shí)空表達(dá)難以有效控制 等特點(diǎn)，使得病毒載體技術(shù)在生命科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用受到一定阻力。
[0008]目前根據(jù)需要已經(jīng)開發(fā)三代腺病毒載體：E1區(qū)或者E1&E3缺失的載體被稱作第一 代腺病毒載體；E2區(qū)或者E2&E4缺失的載體被稱作第二代腺病毒載體；依賴于輔助病毒的 腺病毒載體（Helper-D印endent Ad，HD-Ad)通常也稱作無(wú)償腺病毒或者高容量載體被劃分 為第三代腺病毒載體。
[0009]目前已有的腺病毒載體系統(tǒng)有三種：
[0010] 1、經(jīng)典的雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法（同源重組）
[0011] 原理是同源重組。在腺病毒左臂區(qū)域（通常缺失E1基因區(qū)）插入目的基因表達(dá) 盒構(gòu)成腺病毒穿梭質(zhì)粒，與帶有腺病毒全基因組（通常缺失E1基因區(qū)）的大質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染 攜帶E1基因區(qū)的細(xì)胞如293細(xì)胞，兩種質(zhì)粒在293細(xì)胞內(nèi)通過同源重組形成重組腺病毒基 因組，并包裝成病毒顆粒。主要缺點(diǎn)是重組效率比較低。
[0012] 2、AdEasyTM 包裝系統(tǒng)
[0013] AdEasyTM包裝系統(tǒng)主要的特點(diǎn)是利用原核重組酶在大腸桿菌中完成外源基因插 入腺病毒基因組的過程，獲得環(huán)狀的重組腺病毒基因組，并且具有在細(xì)菌中復(fù)制的必需元 件。將重組腺病毒基因組酶切線性化后轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，避免了雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染得到重組腺病 毒難度大的風(fēng)險(xiǎn)。由于獲得重組腺病毒質(zhì)粒有明顯的篩選方法，操作步驟也比較好掌握，因 此這個(gè)系統(tǒng)一出現(xiàn)就受到極大的歡迎。
[0014] 3、AdMax 包裝系統(tǒng)
[0015] AdMax包裝系統(tǒng)是通過Cre/loxP獲得重組病毒，與目前使用最普及的AdEasy系 統(tǒng)相比，有一定的優(yōu)勢(shì)：AdMax系統(tǒng)只需要2~4周就能完成從質(zhì)粒構(gòu)建到重組出毒，因在 真核細(xì)胞內(nèi)重組出毒，保持了對(duì)腺病毒的生存壓力，有助于重組腺病毒的基因組的完整性； 而AdEasy系統(tǒng)的出毒成功率只有18-34%，且在原核細(xì)胞（BJ5183)中完成病毒基因組重 組，理論上，失去了生存壓力的腺病毒基因組更容易發(fā)生突變，病毒遺傳背景及活性可能會(huì) 受到影響。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 有鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述缺陷，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種安全高效制 備腺病毒的技術(shù)。
[0017] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的細(xì)胞或細(xì)胞系，所述細(xì)胞高表達(dá)ABCB4基 因。
[0018] 進(jìn)一步地，所述"高表達(dá)"是指與野生型的細(xì)胞相比，高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞中 ABCB4基因表達(dá)水平至少高出30%，較佳地高出50%，最佳地高出100%。
[0019] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞是包含外源的ABCB4基因的細(xì)胞。優(yōu)選地，所述細(xì)胞：（a)具 有含有ABCB4基因的載體；或者（b)基因組中整合有外源的ABCB4基因。
[0020] 進(jìn)一步地，所述細(xì)胞中還包含腺病毒載體。
[0021] 優(yōu)選地，所述細(xì)胞或細(xì)胞系為293A細(xì)胞或細(xì)胞系。
[0022] 進(jìn)一步地，所述含有ABCB4基因的載體以pHBLV-CMVIE-IRES-puro質(zhì)粒為骨架。
[0023] 進(jìn)一步地，所述腺病毒載體為pHBAd-U6_GFP質(zhì)粒。
[0024] 優(yōu)選的，所述ABCB4基因的序列如SEQ ID N0. : 1所示。
[0025] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種高效制備腺病毒的方法，包括步驟：
[0026] (1)制備高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞；
[0027] (2)用高表達(dá)ABCB4的細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒。
[0028] 進(jìn)一步地，步驟（1)中所述細(xì)胞為293A細(xì)胞。
[0029] 優(yōu)選地，步驟（1)中所述制備高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞系的方法包括步驟：
[0030] a)構(gòu)建ABCB4慢病毒載體；
[0031] b)慢病毒包裝；
[0032] c)將包裝好的慢病毒感染293A細(xì)胞。
[0033] 優(yōu)選地，步驟a)中使用pHBLV-CMVIE-IRES-puro質(zhì)粒構(gòu)建ABCB4慢病毒載體 pHBLV-CMVIE-IRES-pur〇-ABCB4 QpHBLV-CMVIE-IRES-puro 質(zhì)粒序列如 SEQ ID N0. :4 所示。
[0034] 更優(yōu)選地，構(gòu)建ABCB4慢病毒載體過程中擴(kuò)增ABCB4基因所使用的引物序列為：
[0035] CGTactagtATGGATCTTGAGGCGGCAAAGA(SEQ ID NO. :2);和
[0036] CGTgcggccgcTCATAAGTTCTGTGTCCCAGCC(SEQ ID NO. :3)。
[0037] 優(yōu)選地，步驟b)中，病毒包裝系統(tǒng)包括質(zhì)粒pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒載體。
[0038] 優(yōu)選地，所述 ABCB4 慢病毒載體為 pHBLV-CMVIE-IRES-pur〇-ABCB4。
[0039] 優(yōu)選地，步驟b)中，慢病毒包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞。
[0040] 優(yōu)選地，步驟b)中，慢病毒包裝過程為：
[0041] 培養(yǎng)293T細(xì)胞，胰酶消化后，加入pspax2、pMD2G和ABCB4慢病毒載體組成脂轉(zhuǎn) 體系，轉(zhuǎn)染后收集病毒。優(yōu)選地轉(zhuǎn)染48h和72h。pspax2質(zhì)粒序列如SEQ ID N0. :5所示。 pMD2G質(zhì)粒序列如SEQ ID NO. :6所示。
[0042] 優(yōu)選地，步驟c)中，將包裝好的慢病毒感染293A細(xì)胞得高表達(dá)ABCB4的細(xì)胞系。
[0043] 進(jìn)一步地，步驟2)中，用高表達(dá)ABCB4的細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒的方法包括步驟：
[0044] a)轉(zhuǎn)染
[0045] 將重組腺病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟1)中獲得的高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞系；
[0046] b)收毒
[0047] 轉(zhuǎn)染后，采用反復(fù)凍融