的方式收集病毒；
[0048] c)擴(kuò)增
[0049] 用上一步驟收集的病毒，繼續(xù)感染高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞系，進(jìn)行擴(kuò)增。
[0050] 優(yōu)選地，步驟a)中，腺病毒載體質(zhì)粒為pHBAd-U6-GFP。pHBAd-U6-GFP質(zhì)粒序列如 SEQ ID N0. :7 所示。
[0051] 優(yōu)選地，步驟a)中，轉(zhuǎn)染體系包括：重組腺病毒載體質(zhì)粒pHBAd-U6-GFP、骨架質(zhì)粒 pHBAd-BHG、和 Lipofiter?脂質(zhì)體。pHBAd-BHG 質(zhì)粒序列如 SEQ ID N0. :8 所示。
[0052] 優(yōu)選地，步驟c)中，至少擴(kuò)增兩次。
[0053] 技術(shù)效果
[0054] 使用本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行腺病毒的包裝，總病毒顆粒數(shù)提高了約60%，感染性 滴度提高了約10倍，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案特別適用于對(duì)腺病毒的高效制備。
[0055] 以下將結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的構(gòu)思、具體結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生的技術(shù)效果作進(jìn)一步說(shuō)明，以 充分地了解本發(fā)明的目的、特征和效果。
【附圖說(shuō)明】
[0056] 圖 1 顯示了 pHBLV-CMVIE-IRES-puro 載體圖譜。
[0057] 圖2顯示了 ABCB4基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果。
[0058] 圖3A顯示了 ABCB4慢病毒載體構(gòu)建后的PCR電泳結(jié)果；圖3B顯示了 ABCB4慢病 毒載體酶切鑒定的結(jié)果。
[0059] 圖4顯示了包裝好的慢病毒感染293A細(xì)胞及WB驗(yàn)證的結(jié)果。圖4A為對(duì)照病毒 (左圖）和過(guò)表達(dá)ABCB4目的病毒感染293A細(xì)胞（右圖），顯示病毒成功包裝并感染293A 細(xì)胞。圖4B為ABCB4慢病毒感染293A細(xì)胞后wb鑒定結(jié)果。
[0060] 圖5顯示了重組腺病毒載體pHBAd-U6-GFP質(zhì)粒圖譜。
【具體實(shí)施方式】
[0061] AdMax包裝系統(tǒng)中，腺病毒的重組和包裝是將克隆了外源基因的腺病毒穿梭質(zhì)粒 與攜帶了腺病毒大部分基因組的包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293A細(xì)胞，利用Cre/loxP系統(tǒng)的作用實(shí) 現(xiàn)重組，產(chǎn)生重組腺病毒。那么293A細(xì)胞的狀態(tài)和功能對(duì)于腺病毒的產(chǎn)毒效率，起到了非 常關(guān)鍵的作用。經(jīng)過(guò)發(fā)明人深入的研宄，意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)293A細(xì)胞中的ABCB4基因的 表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，能夠使得腺病毒的產(chǎn)毒效率得到極大的提升。
[0062] ABCB4 基因
[0063] 人ABCB4位于7q21. 1，屬于ABC轉(zhuǎn)運(yùn)家族。ABCB4基因主要在肝臟毛細(xì)膽管膜上 高度表達(dá)，編碼多藥耐藥蛋白3(multidrug resistance protein 3，MDR3)，由ABCB4基因 編碼翻譯的P糖蛋白（P glycoprotein，PgP)Pgp3,主要在肝臟表達(dá)，是ABC(ATP binding cassette，ABC)轉(zhuǎn)運(yùn)體家族的成員之一。肝細(xì)胞外排各種化合物的過(guò)程幾乎都由ABC 家族成員完成。MDR3、PgP3的作用是充當(dāng)依賴ATP的磷脂彈跳酶的角色，將磷脂酰膽堿 (phosphatidyl choline，PC)從肝小葉膽管膜內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)到膜外。ABCB4基因的突變可能會(huì)導(dǎo) 致膽管損傷，從而引起膽汁淤積，繼而引起多種疾病的發(fā)生。
[0064] 本發(fā)明中優(yōu)選的ABCB4目的序列如下：
[0065] >lcl|BC042531. l_cdsid_AAH42531. 1[gene = ABCB4][protein = ATP-binding cassette, sub-family B(MDR/TAP), member 4][protein_id = AAH42531. 1][location = 113..3973]
[0066]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種分離的細(xì)胞或細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞高表達(dá)ABCB4基因。
2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞或細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞是包含外源的ABCB4基因 的細(xì)胞。
3. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞或細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞中還包含腺病毒載體。
4. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞或細(xì)胞系，其特征在于，所述細(xì)胞或細(xì)胞系為293A細(xì)胞或 293A細(xì)胞系；優(yōu)選地，所述細(xì)胞：（a)具有含有ABCB4基因的載體；或者（b)基因組中整合 有外源的ABCB4基因。
5. 如權(quán)利要求4所述的細(xì)胞或細(xì)胞系，其特征在于，所述含有ABCB4基因的載體以 pHBLV-CMVIE-IRES-puro質(zhì)粒為骨架；和/或，所述腺病毒載體為pHBAd-U6-GFP質(zhì)粒。
6. -種高效制備腺病毒的方法，其特征在于，所述方法包括步驟： (1) 制備高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞； (2) 用高表達(dá)ABCB4的細(xì)胞擴(kuò)增腺病毒。
7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中所述細(xì)胞為293A細(xì)胞。
8. 如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述步驟（1)中所述制備高表達(dá)ABCB4基因 的細(xì)胞的方法包括步驟： a) 構(gòu)建ABCB4慢病毒載體； b) 慢病毒包裝； c) 將包裝好的慢病毒感染293A細(xì)胞； 優(yōu)選地，構(gòu)建ABCB4慢病毒載體過(guò)程中擴(kuò)增ABCB4基因所使用的引物序列如SEQID NO. :2 和SEQIDNO. :3 所示。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述步驟b)中，病毒包裝系統(tǒng)包括質(zhì)粒 pSpax2、pMD2G和ABCB4慢病毒載體；優(yōu)選地，步驟b)中，慢病毒包裝細(xì)胞為293T細(xì)胞； 更優(yōu)選地，步驟b)中，慢病毒包裝過(guò)程為： 培養(yǎng)293T細(xì)胞，胰酶消化后，加入pSpax2、pMD2G和ABCB4慢病毒載體組成脂轉(zhuǎn)體系， 轉(zhuǎn)染后收集病毒。
10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟2)中，用高表達(dá)ABCB4的細(xì)胞擴(kuò)增腺 病毒的方法包括步驟： a) 轉(zhuǎn)染 將重組腺病毒載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染步驟1)中獲得的高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞系； b) 收毒 轉(zhuǎn)染后，采用反復(fù)凍融的方式收集病毒； c) 擴(kuò)增 用上一步驟收集的病毒，繼續(xù)感染高表達(dá)ABCB4基因的細(xì)胞系，進(jìn)行擴(kuò)增。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種高效表達(dá)腺病毒的細(xì)胞、及制備腺病毒的方法，經(jīng)過(guò)發(fā)明人深入的研究，意外地發(fā)現(xiàn)，通過(guò)對(duì)293A細(xì)胞中的ABCB4基因的表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控，能夠使得腺病毒的產(chǎn)毒效率得到極大的提升。使用本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行腺病毒的包裝，總病毒顆粒數(shù)提高了約60％，感染性滴度提高了約10倍，說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案特別適用于對(duì)腺病毒的高效制備。
【IPC分類】C12N15-12, C12N5-10, C12R1-93, C12N15-867, C12N7-00
【公開(kāi)號(hào)】CN104789533
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510144423
【發(fā)明人】蔡曉龍, 陳意雄, 鄒杰, 王麗莎, 朱鵬飛, 李明明, 楊龍飛, 許曼蒂, 萬(wàn)穎, 曹青, 卞正雅, 韋唯
【申請(qǐng)人】上海科維創(chuàng)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年7月22日
【申請(qǐng)日】2015年3月30日