一種利用微桿菌降解多種鄰苯二甲酸酯的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術領域，具體地，涉及一種利用微桿菌降解多種鄰苯二甲酸酯的方法。
【背景技術】
[0002]眾多研宄表明，鄰苯二甲酸醋類化合物(Phthalic acid ester，PAEs)具有高毒性，致畸性、致癌性和致突變性，以及生殖毒性。PAEs主要被用作塑料工業(yè)的增塑劑，目前已成為全球最普遍的污染物之一，被美國環(huán)境保護局(EPA)和中國環(huán)境監(jiān)測總站列為優(yōu)先控制污染物(pr1rity pollutant)。根據美國國家癌癥研宄所的研宄結果，其中鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸丁芐酯(BBP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DOP)和鄰苯二甲酸二異辛酯(DEHP)等6種鄰苯二甲酸酯被美國EPA列為優(yōu)先控制污染物。由于塑料制品的大量使用，PAEs廣泛存在于大氣、水體、土壤以及生物體中。由于PAEs是一類疏水性有機污染物，具有較高的辛醇-水分配系數(Kow)，容易吸附于沉積物和土壤顆粒物上。目前我國農業(yè)土壤中PAEs化合物的含量一般在幾yg/kg至幾十mg/kg。已有的調查數據顯示，我國農業(yè)土壤中PAEs化合物有不同程度的超標，部分土壤的個別PAEs化合物超標嚴重，因此PAEs污染土壤的修復問題亟待解決。
[0003]環(huán)境中的PAEs可通過水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途徑。近年來，PAEs的細菌降解已經得到廣泛的研宄，大量高效降解PAEs的菌株已經從各類環(huán)境中分離得到，包括紅樹林、土壤、海洋、河流與廢水處理廠的活性污泥等。然而，大多數已報道的降解菌均是僅對一種鄰苯二甲酸酯具有高效降解能力，而既能夠高效降解簡單的短鏈PAEs又能降解復雜的支鏈或長鏈PAEs的降解菌種質資源很少被發(fā)現。同時，關于微桿菌對PAEs污染土壤的修復效果尚無報道。

【發(fā)明內容】

[0004]本發(fā)明的目的之一是針對當前多種PAEs污染修復技術的不足，提供一種降解多種鄰苯二甲酸酯的方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案可通過以下技術實現:
一種新的可同時高效降解多種PAEs的降解菌，為微桿菌sp.)菌株J-1，于2015年I月22日保藏在中國武漢武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，保藏號為 CCTCC NO: M 2015055，分類命名為sp.J-1。
[0006]本發(fā)明從污水處理廠的活性污泥中分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，并研宄其在多種PAEs污染土壤中的修復效果，結果表明該菌可有效降低土壤中的PAEs污染，是理想的土壤環(huán)境污染修復微生物，具有十分廣泛的應用前景。
[0007]所述微桿菌iMicrobacterium sp.)菌株J-1在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。掃描電鏡下多為球狀或近球狀，直徑0.4~1 μπι。
[0008]所述微桿菌{Microbacteriumsp.)菌株 J-1 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:I所示。通過NCBI官方網站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序與其他已登錄細菌菌株16S rDNA序列進行比對，結果表明該菌株sp.相似性最高，同源率達99%。
[0009]所述微桿菌{Microbacterium sp.)菌株J_1能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分別達到78.92%和71.57%，5天的降解率則達到93.42%和87.02%，7天幾乎全部降解(降解率多98%)。而針對長鏈PAEs，雖然相比短鏈PAEs降解速度較慢，但隨著培養(yǎng)時間的延長，仍能達到較好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分別達到95.07%,91.11%和84.61%。
[0010]一種降解多種PAEs的方法，將微桿菌sp.)菌株J-1接種到含多種PAEs的介質中，在溫度為20~40°C、100~200rpm條件下降解3~7天；
所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO: M 2015055 ;所述多種PAEs為DMP、DEP、DBP、DOP或DEHP中的任意兩種及以上。
[0011]菌株的優(yōu)選降解條件為在溫度為30°C、150rpm條件下降解7天。
[0012]優(yōu)選地，J-1菌株在降解多種PAEs時，將菌株J-1制備成菌懸液接種到含多種PAEs的介質中。
[0013]優(yōu)選地，所述介質為土壤或水。
[0014]優(yōu)選地，所述菌懸液的制備方法為將純化后的菌株J-1接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數期，離心收集菌體，用PBS洗菌后重懸調節(jié)0D_ ? = 0.8-1.2作為菌懸液。
[0015]更優(yōu)選地，所述菌懸液OD6cici M = 1.0o
[0016]優(yōu)選地，所述常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基。
[0017]優(yōu)選地，用PBS洗菌2~4次。
[0018]優(yōu)選地，當介質為水時，多種PAEs的濃度均為200mg L—1時，10mL的水中加入ImL的OD600 M = 1.0的J-1的菌懸液。
[0019]優(yōu)選地，當介質為土壤時，多種PAEs的濃度均為100mg/kg時，200g的土壤中加入50mL的0D_ ? = 1.0的J-1的菌懸液。
[0020]與現有技術相比，本發(fā)明具有以下有益效果:
本發(fā)明公開了一種高效降解多種PAEs的方法，本發(fā)明從污水處理廠的活性污泥中首次分離出一株對多種PAEs具有高效降解能力的微桿菌，該菌株能降解多種PAEs，特別是對短鏈PAEs。本發(fā)明提供的降解菌彌補了菌種資源庫中一菌多效菌種資源的不足；而且該菌在自然界中分布廣泛，適應能力強。同時本發(fā)明提供了該菌株在修復污染土壤中的應用研宄，為PAEs 土壤污染的生物處理提供了技術保障。
【附圖說明】
[0021]圖1為J-1菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)7天的生長形態(tài)特征。
[0022]圖2為J-1菌株的掃描電鏡照片。
[0023]圖3為J-1菌株的16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹。
[0024]圖4為J-1菌株對五種混合PAEs的降解效果。
[0025]圖5為未接菌的污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
[0026]圖6為J-1菌株對污染土壤處理中各PAEs的降解效果。
【具體實施方式】
[0027]下面結合說明書附圖和具體實施例來進一步詳細闡述本發(fā)明。本發(fā)明以下實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，本發(fā)明主要闡述所述菌株以及基于所述菌株的應用思想，實施方式中簡單參數的替換不能一一在實施例中贅述，但并不因此限制本發(fā)明的保護范圍，其他任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，應被視為等效的置換方式，包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
[0028]實施例中所述培養(yǎng)基配方如下:
無機鹽培養(yǎng)液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:
0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最終 pH 為 7.5。
[0029]牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化鈉10.0 g，加超純水至1L，調節(jié)pH= 7.0 ;121°C滅菌20min。固體平板則添加1.5% (w/v)瓊脂粉。
[0030]實施例1菌株的分離與鑒定
采集污水處理廠的活性污泥，稱取5 g活性污泥樣品于含有50 mL無菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培養(yǎng)3天后，取5 mL污泥懸液加入含有100 mL PAEs (分別含50mg/L DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP )的上述MSM培養(yǎng)基中。經30 °C，140 rpm培養(yǎng)7天后，每次按取I mL的接種量連續(xù)富集、轉接10次，并相應提高培養(yǎng)基中PAEs含量至800 mg/L。然后將馴化10次的培養(yǎng)液稀釋103~105涂布于LB固體平板上，30°C倒置培養(yǎng)1~3天。待平板上長出單菌落后，挑取單菌落多次劃線純化，分離獲得一株細菌，編號J-1。然后將菌株接種于LB固體平板上30°C倒置培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)(見圖1)。由圖1可知，J-1菌株在LB培養(yǎng)基上培養(yǎng)七天的菌落較小，呈黃白色，濕潤，凸起，有光澤，邊緣整齊。
[0031]掃描電鏡觀察鑒定:將純化后的J-1菌株接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化。吸取800 μ L菌液經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收獲的菌體沉淀中加入I mL 2.5%戊二醛充分混勻，4°C靜置過夜。然后再次經8000 rpm離心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。隨后將菌體分別在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脫水2次，每個梯度約浸泡15 min,然后8000 rpm離心去上清液，最后用乙酸異戊酯置換乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脫水過程。經過CO2干燥后制片觀察。圖2可見在掃描電鏡下J-1菌體多為球狀或近