球狀，直徑0.4~1 μπι。
[0032]菌株的16S rDNA分子鑒定:提取J-1菌株的總DNA，用細菌16S rDNA通用引物對該菌基因組進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序(由上海生工完成測序)后，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0:1所示。將測序結(jié)果與GenBank中已報道的16S rDNA序列進行同源性比對，并選取相關菌種做進化樹分析。如圖3所示，J-1菌株與Mi crobac teri um res is tensstrain N1T-Cu-1l (GenBank access1n:KJ575058) 和 Mi crobacteri um resis tensstrain AGP4-3 (GenBank access1n: AY277553)講化距離最知.,同源性最高。其培養(yǎng)特征與掃描電鏡觀察特征與微桿菌sp.)也最為相似，因此本發(fā)明篩選獲得的降解菌為微桿菌(IicroAacteria? sp.)。
[0033]因此，發(fā)明人將微桿菌{Microbacterium sp.)菌株J_1保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2015年I月22日，保藏編號是CCTCC NO: M 2015055 ;所述菌株命名為sp.J-1。保藏地址為:中國武漢武漢大學。
[0034]實施例2菌株J-1對多種PAEs的降解效果實驗
S1.菌懸液的制備:將純化后的菌株J-1接入含有10 mL的LB液體培養(yǎng)基過夜活化培養(yǎng)至對數(shù)期，經(jīng)5000 rpm離心10 min收集菌體，用PBS洗菌3次后重懸，調(diào)節(jié)OD6tltl M =1.0作為菌種懸液。
[0035]S2.向含有 200 mg/L 濃度 PAEs (分別含 200 mg/L 的 DMP、DEP、DBP、DOP 和 DEHP )的100 mL MSM培養(yǎng)液中接種上述菌懸液I mL，以不接菌作為對照，并調(diào)節(jié)pH為7.0，每組三個重復。在30°C，150 rpm恒溫搖床培養(yǎng)7天，分別于0，I，3，5，7天取樣并抽提樣品，經(jīng)GC/MS測定樣品中DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP的降解情況。
[0036]S3.樣品處理:將在搖瓶中培養(yǎng)后的樣品100 mL轉(zhuǎn)移入分液漏斗，加入20 mL 二氯甲烷振蕩萃取10 min，用150 mL三角瓶收集有機相(下相)，分液漏斗中的水相再加入20mL的二氯甲烷相同方法振蕩萃取3次，合并有機相，然后過含有18 cm已烘干的無水Na2SO4玻璃柱(1.5 cmX35 cm)進行干燥，用雞心瓶收集濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸干后定容10 mL待測。
[0037]色譜條件:采用島津公司QP2010 Plus型GC/MS串聯(lián)質(zhì)譜儀。色譜柱為安捷倫HP-5柱子(0.25 μπι X 0.25 mm X 30 m)，進樣溫度為250°C，離子源(EI)溫度為220°C，采用不分流進樣I UL，載氣為高純氦氣。升溫程序為:初始溫度為100°C，保持2 min，15°C/min梯度上升至129°C，然后以40 °C /min升溫至280 °C，保持5min。
[0038]質(zhì)量控制:采用外標法和六點校正標準物質(zhì)制作標準曲線。6種PAEs混標的基質(zhì)加標平均回收率為90.5-107.6%，相對偏差低于10.7%，儀器檢測限為0.62-1.22 ug/mL。
[0039]由附圖4可知，隨著培養(yǎng)時間的延長，五種PAEs的降解率顯著上升。特別是對短鏈PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分別達到78.92%和71.57%，5天的降解率則達到93.42%和87.02%，7天幾乎全部降解(降解率彡98%)。而針對長鏈PAEs，雖然相比短鏈PAEs降解速度較慢，但隨著培養(yǎng)時間的延長，仍能達到較好的降解效果。7天DBP、D0P和DEHP的降解率分別達到95.07%,91.11%和84.61%。同時也說明，J-1菌更易于利用短鏈和長直鏈PAEs，對于帶有長支鏈的DEHP降解效果相對較差，但7天的降解率也超過80%，說明該菌能夠高效的利用各種PAEs，可以作為PAEs污染環(huán)境生物處理的理想微生物。
[0040]實施例3菌株J-1對多種PAEs污染土壤的修復效果
S1.供試土壤制備:土壤為華南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)場水稻土，風干后過60目篩，pH為6.7，向其中添加五種PAEs (包括DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP)，使土壤中各PAE含量分別達到100mg/kg，并加雙蒸水調(diào)至田間持水量(約30%)，避光老化15天。
[0041]S2.實驗處理:分別稱取上述含100 mg kg4 DBP的土壤200 g于三角瓶中，向土壤中添加菌懸液50 mL，充分混勻，另外不接菌的處理為對照組。將土壤調(diào)至田間持水量(約30%的含水量)，在30°C恒溫箱中避光培養(yǎng)，分別于0，2，4，6，8，10天定期取樣抽提，然后經(jīng)GC/MS測定土壤中各PAEs殘留量。
[0042]S3.樣品抽提:稱取I g風干磨碎的土壤樣品于35 mL玻璃離心管中，加入20 mL的二氯甲烷并超聲萃取10 min，然后經(jīng)3500 rpm離心收集上清液。土樣沉淀中再加入20mL的二氯甲烷相同方法超聲萃取3次，合并上清液。然后經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮上清液，用二氯甲燒超聲清洗后過柱子(1.0 cm X 35 cm，填料自上而下為無水Na2SO4，娃膠和氧化銷)，用雞心瓶收集濾液經(jīng)N2吹干后，用色譜純二氯甲烷重新溶解并定容至I mL，待GC/MS測定。
[0043]GC/MS色譜條件同上所述。
[0044]質(zhì)量控制:采用外標法和六點校正標準物質(zhì)制作標準曲線。6種PAEs混標的基質(zhì)加標平均回收率為92.5-110.2%，相對偏差低于10.5%，儀器檢測限為0.12-0.45 ug g'該方法滿足痕量有機物定量分析要求。
[0045]如圖6所示，與未接菌的污染土壤中PAEs降解效果(圖5)相比，Mi crobac teri umsp.J-1菌顯著增強了土壤中各PAEs的降解效果。與純培養(yǎng)結(jié)果一致，J-1菌對短鏈PAEs(如DMP、DEP)的降解效率較高，10天的降解率均超過了 95%。對長直鏈的DBP和DOP的降解效果也較好，10天的降解率分別為91.51%和79.98%ο對長支鏈的DEHP的10天降解率為69.71%。而10天的未接菌的土壤中DMP、DEP、DBP、DOP、DEHP降解率分別為21.37%,17.83%, 11.84%, 9.62%, 6.88%?？梢姡琈icrobacterium J-1 菌能夠顯著提高污染土壤中PAEs的消除，在PAEs污染土壤修復中具有良好的應用潛力。
【主權(quán)項】
1.一種降解多種PAEs的方法，其特征在于，將微桿菌(Microbacterium sp.)菌株J-1接種到含多種PAEs的介質(zhì)中，在溫度為20~40°C、100~200rpm條件下降解3~7天； 所述菌株于2015年I月22日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO:M 2015055 ； 所述多種PAEs為DMP、DEP、DBP、DOP或DEHP中的任意兩種及以上。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，在溫度為30°C、150rpm條件下降解7天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述介質(zhì)為土壤或水。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的應用，其特征在于，將菌株J-1制備成菌懸液接種到含多種PAEs的介質(zhì)中。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述菌懸液的制備方法為將純化后的菌株J-1接入常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，用PBS洗菌后重懸調(diào)節(jié)OD600 ? = 0.8-1.2作為菌懸液。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述菌懸液OD6tltlnm= 1.0。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述常規(guī)微生物液體培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基、NA液體培養(yǎng)基或PDA液體培養(yǎng)基。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，用PBS洗菌2~4次。
9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當介質(zhì)為水時，多種PAEs的濃度均為200mg L-1時，10mL的水中加入ImL的OD 600 ■ = 1.0的J-1的菌懸液，30°C、150rpm條件下降解7天。
10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，當介質(zhì)為土壤時，多種PAEs的濃度均為100mg/kg 時，200g 的土壤中加入 50mL 的 OD6tltl M = 1.0 的 J-1 的菌懸液，30°C、150rpm 條件下降解7天。
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境污染物生物處理技術(shù)領域，具體公開了一種利用微桿菌降解多種鄰苯二甲酸酯的方法。本發(fā)明利用從污水處理廠的活性污泥中首次分離的一株微桿菌用于降解多種PAEs，尤其是短鏈PAEs，其降解效果特別顯著，該方法可以有效修復多種PAEs污染的介質(zhì)。CCTCC NO：M 201505520150122
【IPC分類】C02F3-34, B09C1-10, C02F101-34, C12R1-01, C12N1-20
【公開號】CN104805034
【申請?zhí)枴緾N201510066128
【發(fā)明人】趙海明, 莫測輝, 李彥文, 蔡全英, 李慧, 馮乃憲, 林靜, 杜歡
【申請人】暨南大學
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年2月9日