片段；所述融合膚的化片段包含人或者人源化的化片段，優(yōu) 選地，該融合膚的化片段包含人IgG化片段。
[0033] 在一種實(shí)施方式中，所述單價(jià)單元的人IgG化段和所述單鏈單元的IgG化通過 鹽橋和隆突-入-穴結(jié)構(gòu)連接。
[0034] 在一種實(shí)施方式中，提供一種雙特異性抗體的制備方法，所述方法包括：
[0035] (1)分別將單價(jià)單元的重、輕鏈分別構(gòu)建到第一表達(dá)載體上，將單鏈單元構(gòu)建到第 二表達(dá)載體上；
[0036] (2)將第一和第二表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)并取上清；
[0037] (3)將表達(dá)上清分離得到純化后的雙特異性抗體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞是CHO-S細(xì) 胞；或者優(yōu)選地，所述分離步驟包括：蛋白A親和層析柱從表達(dá)上清中捕獲所有帶化結(jié)構(gòu) 域的抗體，通過SP陽離子交換層析實(shí)現(xiàn)目標(biāo)雙特異性抗體與副產(chǎn)物的分離，再過Q柱，最后 濃縮置換緩沖液PBS。
[003引在一種實(shí)施方式中，第一表達(dá)載體是pCHOl. 0 ;第二表達(dá)載體是pCHOl. 0-潮霉素。
[0039] 在一種實(shí)施方式中，所述單價(jià)單元為抗-CD3抗體，擴(kuò)增其輕鏈所用引物為 Kozak(EcoRV)F、MK-Leader(EcoRV)F、L2K-VL(MK)F1 和hi巧(PacI)R，通過重疊PCR擴(kuò) 增，將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)EcoRV與化cl引入輕鏈；擴(kuò)增其重鏈所用引物為 Kozak(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F、L2K-VH(MK)F1 和hlgGl(sbfI)R，通過重疊PCR擴(kuò)增， 將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入重鏈；將擴(kuò)增好的LC基因片段 與用EcoRV與化cl酶切過的pC冊1. 0表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗-CD3輕鏈的表 達(dá)載體；然后用Avrn與BstZ17I酶切后再和肥進(jìn)行同源重組，獲得抗-CD3的pCHOl. 0表 達(dá)載體，質(zhì)粒命名為pCHOl. 0-抗-CD3-HL-LDY;
[0040] 所述單鏈單元為抗-CD19ScFv-Fc抗體，擴(kuò)增其所用引物為Kozak(AvrII) F、MK-Leader(AvrII)F、MK-Leader(AvrII)F和hhlgGl(sbfI)R，通過PCR擴(kuò)增抗CD19 ScFv-化結(jié)構(gòu)域，并將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)Avrn與BstZ17I引入ScFv-Fc，將 擴(kuò)增好的基因片段與酶切過的pCHOl. 0-潮霉素表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗CD19 ScFv-化的表達(dá)載體，質(zhì)粒命名為pCHOl. 0-潮霉素-抗CD19-ScFv-Fc-KKW。
[0041] 在一種實(shí)施方式中，上述任一的雙特異性抗體或者按照上述任一方法制備的雙特 異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療CD19特異抗原表達(dá)所引起的腫瘤或相 關(guān)疾病，或者用于殺死表達(dá)CD19細(xì)胞。
[0042] 在一種實(shí)施方式中，上述任一的雙特異性抗體或者按照上述任一方法制備的雙特 異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在人腫瘤細(xì)胞系中篩選用于治療表達(dá)CD19 特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物或者評(píng)價(jià)用于治療表達(dá)CD19特異抗原的腫瘤細(xì)胞相 關(guān)疾病的藥物的藥效。本發(fā)明還提供了W下的技術(shù)方案：
[0043] 本發(fā)明提供了一種新方法制備雙特異性抗體SMB0DY(ScFvandmonomer bispecificantibody,如圖2所示），該雙特異性抗體包括兩組重輕鏈組合，其中一組特異 結(jié)合一種抗原，并且在其重鏈化區(qū)進(jìn)行一些改造，使其相對野生型，不易自身形成二聚體； 而另一組特異結(jié)合另一種抗原，同樣在其重鏈化區(qū)進(jìn)行另外一些改造，也不易自身形成二 聚體，而該兩組重輕鏈之間很容易形成雜合二聚體。并且其中一組的抗體結(jié)構(gòu)為單聚體Ab， 另一組為ScFv-Fc，該樣就避免了各自輕鏈與對方重鏈錯(cuò)配的可能性，從而形成125KD的雙 特異性抗體蛋白分子。Fc改造后，單聚體Ab的重鏈和單鏈自然異二聚化，同時(shí)CL和CH1間 自然二聚化，最后形成SMB0DY，SMB0DY各結(jié)構(gòu)域排列順序及結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。
[0044] 本發(fā)明中利用W上制備雙特異性抗體的方法，制備雙特異性抗體。其中是WCD19 和人源CD3為祀點(diǎn)的雙特異性抗體，被命名為M902,如圖2,抗-CD3該邊為IgG形式，包括 抗-CD3重鏈與輕鏈，抗-CD19該邊為ScFv-化形式，包括抗-CD19VH、VL、化結(jié)構(gòu)域。W上 雙特異性抗體通過抗體基因工程方法進(jìn)行構(gòu)建，雙特異性抗體SMBODY的單聚體Ab重鏈和 單聚體Ab輕鏈二元表達(dá)載體，W及ScFv-Fc表達(dá)載體。根據(jù)LC，肥，ScFv，化基因序列及載 體中的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。其中LC，肥，ScFv和化分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過PCR或重疊 延伸PCR法獲得基因片段，然后通過同源重組法進(jìn)行克隆。酶切pCHOl. 0或pCHOl. 0-潮霉 素載體，然后純化回收PCR產(chǎn)物和酶切后的載體，分二步分別將LC片段，HC片段同源重組克 隆到pCHOl. 0載體上，ScFv-化片段同源重組克隆到pCHOl. 0-潮霉素載體上，并測序。重組 蛋白質(zhì)SMBODY在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的表達(dá)、檢測，使用轉(zhuǎn)染試劑將分別表達(dá)單價(jià)單元重鏈、 單價(jià)單元輕鏈和單鏈單元的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，再收集上清進(jìn)行SDS-PAGE和 蛋白質(zhì)印跡檢測SMBODY的表達(dá)情況。將轉(zhuǎn)染表達(dá)后的培養(yǎng)液上清離屯、，過濾，用結(jié)合緩沖 液稀釋，過親和層析柱，洗脫緩沖液洗脫，SDS-PAGE檢測純化蛋白質(zhì)。
[0045] 本發(fā)明的技術(shù)方案的有益的技術(shù)效果有；
[0046] 1.本申請?zhí)峁┝艘环N異二聚體抗體，該抗體包含兩個(gè)不同的抗原結(jié)合多膚單元。 該異二聚體與其對應(yīng)的同二聚體分子量大小不同，可利用分子量的大小來區(qū)別異二聚體和 同二聚體，從而較方便的確定雙特異性抗體的純度。該兩個(gè)抗原結(jié)合多膚單元之一包含類 似于野生型抗體的輕鏈-重鏈對，在整個(gè)本申請中，該單元也稱為"單價(jià)單元"。另一抗原結(jié) 合多膚單元包含單鏈可變片段（ScFv)。該樣的ScFv可融合至抗體的恒定片段（Fc)。在本 申請全文中此融合膚也被稱為"單鏈單元"。
[0047] 2.本發(fā)明公開了一種新型雙特異性抗體SMBODY(ScFvandmonomerbispecific antibody)介導(dǎo)的免疫細(xì)胞殺傷體外藥效的建立及其應(yīng)用。本發(fā)明包括雙特異性抗體藥物 研究過程中所介導(dǎo)的免疫細(xì)胞殺傷、雙特異性抗體的制備，W及雙特異性抗體體外藥效模 型的建立和檢測。雙特異性抗體SMBODY包括一組單價(jià)單元（重輕鏈組合），另一組則為單 鏈單元（ScFv連接化組合），其中單鏈單元特異結(jié)合一種人的腫瘤細(xì)胞抗原，包括CD19等 一系列腫瘤細(xì)胞膜表面抗原，并且在其重鏈化區(qū)進(jìn)行一些改造，使其相對野生型，不易自 身形成二聚體；而另一組單價(jià)單元特異結(jié)合另一種人的T細(xì)胞抗原CD3,同樣在其重鏈化 區(qū)進(jìn)行另外一些改造，也不易自身形成二聚體，而該兩組單元之間很容易形成異二聚體。與 此同時(shí)，雙特異性抗體能在祀細(xì)胞和功能分子（細(xì)胞）之間架起橋梁，激發(fā)具有導(dǎo)向性的免 疫反應(yīng)，在腫瘤的免疫治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0048] 令人驚奇的是，本申請證明該種非對稱的抗體是穩(wěn)定的并具有高的抗原結(jié) 合效率。該是令人感到意外的，因?yàn)橐呀?jīng)證實(shí)在生理?xiàng)l件下即使是單鏈抗體的同二 聚體都是不穩(wěn)定的。例如，Ahmad等的ScFvAntibody:PrinciplesandClinical Application,"ClinicalandDevelopmentalImmunology, 2012:980250(2012),顯不基于 ScFv的IgG類抗體不穩(wěn)定，并且需要進(jìn)一步改造W減少聚集并提高穩(wěn)定性。
[0049] 另外，因?yàn)榫哂蟹菍ΨQ性，異二聚體具有與由其中任一抗原結(jié)合多膚單元組成的 同二聚體所不同的等電點(diǎn)?；诋惗垠w和同二聚體之間的等電點(diǎn)差異，可W容易地將需 要的異二聚體與同二聚體分離，大大減少了雙特異性抗體普遍存在的下游工藝開發(fā)存在的 困難。
【附圖說明】
[0化0] 為了更清楚地說明本申請實(shí)施例中的技術(shù)方案，下面將對實(shí)施例中所需要使用的 附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本申請中記載的一些實(shí)施例，對 于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來來說，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可W根據(jù)該些附圖獲得 其它的附圖，其中：
[0化1]圖1. CD3分子結(jié)構(gòu)示意圖。
[0化2]圖2. CD19 X CD3 SMBODY雙特異性抗體分子示意圖。
[0化3]圖3.電泳檢測PCR產(chǎn)物結(jié)果圖；(A)M ;化1000核酸分子標(biāo)記；1.抗CD3抗體輕鏈； 炬)M;DL2000核酸分子標(biāo)記；1.抗CD3抗體重鏈；2.抗CD19抗體ScFv-Fc。
[0化4]圖4.純化的雙抗體電泳及純度檢測結(jié)果圖；(A)SDS-PAGE電泳，M ;蛋白分子量 標(biāo)記；1 :非還原性CD19XCD3 SMBODY雙抗體；2 ;還原性CD19XCD3 SMBODY雙抗體；炬） CD19XCD3的HPLC-SEC純度峰形圖。
[0化5]圖5.基于流式細(xì)胞分析方法測定抗體與Raji細(xì)胞的親和力結(jié)果圖，（)CD19XCD3SMB0DY(M902) ; ( ? )Anti-CD19 單克隆抗體。
[0化6]圖6.基于流式細(xì)胞分析方法測定抗體與化rkat細(xì)胞的親和力結(jié)果圖，（)CD19XCD3SMBODY(M902) ;(? )Anti-CD3 單克隆抗體L2K。
[0057]圖7.流式檢測CD19XCD3雙抗體同時(shí)結(jié)合Raji和化rkat細(xì)胞情況圖；（?）為CD19XCD3 SMB0DY(M902)雙抗體；（)對照抗體MT103。
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