化引圖8.抗體經(jīng)過熱處理后活性檢測圖，A.與CD19結(jié)合活性檢測，（?）CD19XCD3(M902)雙抗體；（ )Anti-CD19單克隆抗體；B.與CD3結(jié)合活性檢測，（?） CD19XCD3(M902)雙抗體；（ )Anti-CD3 單克隆抗體L2K。
[0059] 圖9.CIK表型檢測圖，右上角的CD3,CD56雙陽性的NK類細(xì)胞。
[0060] 圖10.流式檢測不同濃度抗體存在條件下，效應(yīng)細(xì)胞CIK對(duì)祀細(xì)胞Raji的殺 傷作用結(jié)果圖；M902 ;CD19XCD3雙抗體，▼AC19 ;Anti-CD19單抗，▲McolOl ;對(duì)照 4420XCD3雙抗體，?hIgG ;人IgG。
[0061] 圖11.流式檢測不同濃度抗體存在條件下，效應(yīng)細(xì)胞PBMC對(duì)祀細(xì)胞Raji的殺傷 作用結(jié)果圖；國1902 ;CD19XCD3雙抗體，▼Anti-CD19 ;抗CD19單抗，AMcolOl ;對(duì)照4420 X CD3雙抗體，?hIgG;人IgG。
【具體實(shí)施方式】
[0062] 實(shí)施例1;雙特異性抗體的表達(dá)載體構(gòu)建（CD19XCD3,M902)
[0063] 1.雙特異性抗體序列設(shè)計(jì)
[0064]WCD19和CD3為祀點(diǎn)的雙特異性抗體被命名為CD19XCD3,如圖2,抗CD19該邊 為ScFv-化形式，包括抗-CD19VH、VL、化結(jié)構(gòu)域；抗CD3該邊為IgG形式，包括抗CD3重 鏈與輕鏈，含有F油和化結(jié)構(gòu)域。其中ScFv-Fc-邊化進(jìn)行KKW改造，IgG形式一邊化 進(jìn)行LDY改造，具體化改造過程參見PCT/CN2012/084982,使其各自不易形成同源二聚體， 而易于形成雜合二聚體，即CD19XCD3雙特異性抗體。同時(shí)，為了雙抗體能在CH0細(xì)胞中表 達(dá)，并能分泌到培養(yǎng)基中，選擇了鼠kappa鏈的前導(dǎo)膚序列作為分泌信號(hào)膚。各個(gè)結(jié)構(gòu)域及 信號(hào)膚的氨基酸序列和核酸序列見如下SEQIDNO: 1-8。
[00化]抗-CD3重鏈氨基酸序列（序列號(hào)1)
[0066] DIKLQQSGAELARPGASVKMSCKTSGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKAT LTTDKSSSTAYMQLS化TS邸SAVYYCARYY孤HY化DYWGQGTTLTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGC LV邸YFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLY化SSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCD KTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKP邸TLMISRWEVTCVVVDVS肥DPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNS TYRVVS化TVLHQDWLNG邸YKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS畑化TKNQV化TCRVKGFYPS DIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLKSDGSF化ASKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM肥ALHNHYTQK化化SPGK
[0067] 抗-CD3重鏈核酸序列（序列號(hào)2)
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 雙特異性抗體，其特征在于，所述該抗體包含：(a)單價(jià)單元，為輕鏈-重鏈對(duì)，該輕 鏈-重鏈對(duì)針對(duì)免疫細(xì)胞選自T細(xì)胞、NKT細(xì)胞或CIK細(xì)胞；優(yōu)選地，該輕鏈-重鏈對(duì)對(duì)免 疫細(xì)胞表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力；和（b)單鏈單元，為融合肽，該融合肽包含單鏈 可變片段ScFv和具有鉸鏈區(qū)、CH2結(jié)構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域的Fc片段，其中該融合肽針對(duì)腫 瘤細(xì)胞表面抗原具有特異性結(jié)合能力，優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是CD19、CD20、CD30和 CD133,更優(yōu)選地該腫瘤細(xì)胞表面抗原是CD19。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：單鏈單元的CH2結(jié)構(gòu)域位于ScFv 片段和CH3結(jié)構(gòu)域之間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單鏈可變片段由輕鏈可變區(qū) 和重鏈可變區(qū)結(jié)構(gòu)域組成，它們都靶向于抗原表位CD19。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：在所述單價(jià)單元中，輕鏈通過二硫 鍵與重鏈結(jié)合；所述重鏈通過一個(gè)或多個(gè)二硫鍵與所述融合肽結(jié)合。
5. 權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：單鏈單元包括針對(duì)CD19的抗體 抗-CD19,單價(jià)單元包括針對(duì)CD3的抗體抗-CD3 ; 優(yōu)選地，所述抗-CD3重鏈的氨基酸序列為序列號(hào)1所示的氨基酸序列，抗-CD3的輕鏈 氨基酸序列為序列號(hào)3所示的氨基酸序列，以及所述抗-CD19ScFV-Fc的氨基酸序列為序列 號(hào)5所示的氨基酸序列；并且抗-⑶3重鏈在222位點(diǎn)上的半胱氨酸與抗-⑶3的輕鏈213 位點(diǎn)上的半胱氨酸以二硫鍵的形式連接，所述的抗-CD3重鏈在228和231位點(diǎn)上的半胱氨 酸與抗-⑶19ScFv-Fc的265和268位點(diǎn)上的半胱氨酸分別以二硫鍵的形式連接，所述的 抗-⑶3重鏈在394和411位點(diǎn)上與抗一⑶19ScFv-Fc的438和407位點(diǎn)上形成鹽橋連接， 所述的抗-⑶3重鏈在368位點(diǎn)上與抗-⑶19ScFv-Fc的443位點(diǎn)上形成隆突-入-穴連接。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價(jià)單元中的重鏈包含人或 者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該重鏈的Fc片段包含人IgG Fc片段；所述融合肽的Fc片段 包含人或者人源化的Fc片段，優(yōu)選地，該融合肽的Fc片段包含人IgG Fc片段。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述雙特異性抗體，其特征在于：所述單價(jià)單元的人IgG Fc段和所 述單鏈單元的IgG Fc通過鹽橋和隆突-入-穴結(jié)構(gòu)連接。
8. 制備權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體的方法，其特征在于，所述方法包括 步驟： (1) 分別將單價(jià)單元的重、輕鏈分別構(gòu)建到第一表達(dá)載體上，將單鏈單元構(gòu)建到第二表 達(dá)載體上； (2) 將第一和第二表達(dá)載體一起共轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，培養(yǎng)并取上清； (3) 將表達(dá)上清分離得到純化后的雙特異性抗體；優(yōu)選地，所述細(xì)胞是CHO-S細(xì)胞；或 者優(yōu)選地，所述分離步驟包括：蛋白A親和層析柱從表達(dá)上清中捕獲所有帶Fc結(jié)構(gòu)域的抗 體，通過SP陽離子交換層析實(shí)現(xiàn)目標(biāo)雙特異性抗體與副產(chǎn)物的分離，再過Q柱，最后濃縮置 換緩沖液PBS。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，所述第一表達(dá)載體是pCHOl. 0 ;所述第二表達(dá)載體是 pCHOl. 0-潮霉素。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述方法的步驟（1)中： 所述單價(jià)單元為抗-CD3抗體，擴(kuò)增其輕鏈所用引物為Kozak (EcoR V)F、 MK-Leader (EcoRV)F、L2K-VL(MK)Fl 和 hlgK(PacI)R，通過重疊 PCR 擴(kuò)增，將 Kozak 序列、 前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)EcoR V與PacI引入輕鏈；擴(kuò)增其重鏈所用引物為Kozak(Avr II)F、 MK-Leader (AvrII)F、L2K-VH(MK)Fl 和 hlgGl (sbfl) R，通過重疊 PCR 擴(kuò)增，將 Kozak 序列、 前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入重鏈；將擴(kuò)增好的LC基因片段與用EcoR V與 PacI酶切過的pCHOl. 0表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗-⑶3輕鏈的表達(dá)載體；然后用 AvrII與BstZ17I酶切后再和HC進(jìn)行同源重組，獲得抗-⑶3的pCHOl. O表達(dá)載體，質(zhì)粒命 名為 pCHOl. O-抗-CD3-HL-LDY ; 所述單鏈單元為抗-⑶19ScFv-Fc抗體，擴(kuò)增其所用引物為Kozak (Avr II) F、 MK-Leader (AvrII)F、MK-Leader (AvrII)F和 h hlgGl (sbfl) R，通過PCR擴(kuò)增抗CD19ScFv_Fc 結(jié)構(gòu)域，并將Kozak序列、前導(dǎo)序列及酶切位點(diǎn)AvrII與BstZ17I引入ScFv-Fc，將擴(kuò)增好的 基因片段與酶切過的pCHOl. 0-潮霉素表達(dá)載體進(jìn)行同源重組，獲得裝入抗⑶19ScFv-Fc的 表達(dá)載體，質(zhì)粒命名為pCHOl. 0-潮霉素-抗CD19-ScFv-Fc-KKW。
11. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)制備 的雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于治療CD 19 特異抗原表達(dá)所引起的腫瘤或相關(guān)疾病，或者用于殺死表達(dá)CD19細(xì)胞。
12. 權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述雙特異性抗體或者按照權(quán)利要求8-10中任一項(xiàng)制備的 雙特異性抗體的方法制備的雙特異性抗體在制備藥物中的用途，所述藥物用于在腫瘤細(xì)胞 系中篩選用于治療表達(dá)CD19特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物或者評(píng)價(jià)用于治療表達(dá) CD19特異抗原的腫瘤細(xì)胞相關(guān)疾病的藥物的藥效。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種雙特異性抗體，本申請(qǐng)的雙特異性抗體由單鏈單元和單價(jià)單元組成，其中該單價(jià)單元針對(duì)免疫細(xì)胞的表面抗原CD3具有特異性結(jié)合能力，該單鏈單元針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原CD19具有特異性結(jié)合能力；該單鏈單元包含與Fc片段融合的單鏈可變片段(ScFv)，該單價(jià)單元包含輕鏈和重鏈對(duì)。本申請(qǐng)還提供雙特異性抗體的制備方法，這些抗體的藥學(xué)用途。
【IPC分類】C12N15-85, C07K16-30, C07K16-46, A61P35-00, A61K39-395
【公開號(hào)】CN104829727
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510029982
【發(fā)明人】張敬, 劉曉燕, 付思思, 劉金剛, 范克索, 周鵬飛
【申請(qǐng)人】武漢友芝友生物制藥有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年1月21日