一株原油降解菌株及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株原油降解菌株以及該菌株在生物修復(fù)中的 應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在石油的開采、運輸和使用中，經(jīng)常會有石油外泄或排放不當(dāng)?shù)那闆r發(fā)生。生物修 復(fù)法是指烴降解微生物能夠利用原油為碳源生長，把原油降解成其他低分子量的產(chǎn)物，具 有經(jīng)濟、效果顯著、環(huán)保等優(yōu)點。
[0003]目前已發(fā)現(xiàn)具有原油降解能力的微生物菌株70屬200余種。自然菌降解原油的 效率普遍不高，石油烴污染物的生物可利用性是主要限制因素之一。
[0004] 研宄發(fā)現(xiàn)，生物表面活性劑能夠顯著促進石油的降解效率。生物表面活性劑是指 由微生物分泌的同時具有親水性基團和疏水性基團的化合物，鼠李糖脂是研宄最常見的一 種糖脂類生物表面活性劑。
[0005] -些有毒或難降解的物質(zhì)很難被微生物直接利用，但添加易被微生物降解的物質(zhì) 如葡萄糖等，即可以促進或啟動難降解物質(zhì)的降解。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明提供了一株原油降解菌株及其應(yīng)用，該菌株是一株具有較高的降解原油能 力和鼠李糖脂生產(chǎn)能力的銅綠假單胞菌菌株，可應(yīng)用于原油污染環(huán)境的生物修復(fù)，本發(fā)明 還提供了一種從原油中富集和分離微生物的方法。
[0007] 本發(fā)明實現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：
[0008] -株原油降解菌株，名稱為D1，分類名稱為Pseudomonas aeruginosa，保藏編號 為：CGMCC No. 10287,保藏日期：2015年01月07日，北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，保 藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。
[0009] 而且，所述菌株具有鼠李糖脂生產(chǎn)能力和降解原油的能力。
[0010] 原油降解菌株生產(chǎn)鼠李糖脂的應(yīng)用。
[0011] 而且，所述菌株利用甘油或菜籽油生產(chǎn)鼠李糖脂。
[0012] 原油降解菌株在原油污染的生物修復(fù)中的應(yīng)用。
[0013] 而且，所述菌株在原油培養(yǎng)基中添加0. 5g/L甘油，原油降解率為72. 5%。
[0014] 而且，所述菌株在10d內(nèi)對原油的降解率為35. 6%。
[0015] 原油降解菌株的篩選方法，具體步驟如下：
[0016] ⑴首先將原油中的微生物富集：將原油加入到無菌的無機鹽培養(yǎng)基中，35°C恒溫 振蕩培養(yǎng)，直到無色的無機鹽培養(yǎng)基變的渾濁；
[0017] ⑵菌株產(chǎn)鼠李糖脂與否的鑒定：將培養(yǎng)液用生理鹽水稀釋后涂布在CTAB瓊脂平 板上，菌落周圍具有深藍色暈圈說明菌株可以分泌鼠李糖脂；
[0018] ⑶挑選一個菌落保存，由于菌株直接從原油中篩選得到，具有一定的原油降解能 力。
[0019] 原油降解菌株降解石油污染的方法，利用補充限量甘油的無機鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株 D1，將培養(yǎng)物直接噴灑在泄露的原油表面，或者與原油污染的土壤混合，或者接種到原油污 染的水域即可。
[0020]而且，所述無機鹽培養(yǎng)基：NaCl lg/L、KC1 lg/L、NaN03 6g/L、KH2P04 3g/L、 Na2HP04g/L 0? 3、MgS04 2. 5g/L、CaCl2 lg/L、微量元素溶液 lmL/L，培養(yǎng)基的 pH 為 6. 8,微 量元素溶液配方為：FeCl3 0? 16g/L、ZnS04 1. 5g/L、CuS04 0? 15g/L、MnS04 1. 5g/L、H3B03 1. 5g/L〇
[0021] 本發(fā)明的取得的優(yōu)點和有益效果是：
[0022] 1、本發(fā)明提供的原油降解菌株降解原油能力強，菌株在以原油為唯一碳源的培養(yǎng) 基中生長良好，細菌濃度（cfu/mL)增加到了 4. 7X109,且通過10d的培養(yǎng)將原油的濃度從 0. 78g/L降低到了 0. 60g/L。進而通過向原油培養(yǎng)基中添加少量甘油，結(jié)果證明能夠大大加 快原油降解的效率，原油濃度下降到了 〇. 22g/L。彌補了目前仍采用物理或化學(xué)等去除原油 的方法，以及自然界的微生物原油降解效率低下的缺陷；同時，由于該原油降解菌株具有較 強的鼠李糖脂生產(chǎn)能力，能夠應(yīng)用于鼠李糖脂大規(guī)模生產(chǎn)。
[0023] 2、本發(fā)明提供的原油降解菌株的分離方法主要利用在富集培養(yǎng)基和選擇性培養(yǎng) 基上來富集和分離菌株，通過16S rRNA鑒定菌株，并且通過測定鼠李糖脂濃度和培養(yǎng)基殘 余原油濃度測定分離菌株的鼠李糖脂生產(chǎn)能力和原油降解能力，工藝相對簡單，篩選菌株 準(zhǔn)確，為微生物法治理原油污染提供了新思路。
【附圖說明】：
[0024] 圖1為本發(fā)明篩選方法篩選出的1株菌株在CTAB瓊脂平板上的生長情況；
[0025]圖2為本發(fā)明1株分離菌株在不同碳氫化合物培養(yǎng)基中的生長情況；
[0026] 圖3為本發(fā)明分離菌株發(fā)育樹的構(gòu)建圖；
[0027] 圖4為本發(fā)明原油濃度測定方法中原油溶液的全波長掃描；
[0028] 圖5為本發(fā)明中菌株對原油降解能力；
[0029] 圖6為本發(fā)明少量甘油對原油降解的影響，圖6-1為添加甘油前后原油降解效果 圖；圖6-2為添加甘油前后菌落數(shù)對比圖；圖6-3為添加甘油前后原油濃度對比圖。
【具體實施方式】：
[0030] 下面通過具體實施例對本發(fā)明作進一步詳述，以下實施例只是描述性的，不是限 定性的，不能以此限定本發(fā)明的保護范圍。
[0031] 本發(fā)明直接從原油中篩選得到一株細菌，通過鑒定確定篩選菌株為銅綠假單胞 菌。此菌株具有分泌鼠李糖脂的能力，和原油降解能力，且在原油降解過程中添加少量的甘 油能夠有效促進原油降解。
[0032] 需要說明的是：菌株直接從原油中分離得到，且培養(yǎng)基中只含有原油一種碳源，菌 株對原油具有一定的利用能力，即菌株能夠一定程度上降解原油。
[0033] 原油降解菌株的篩選方法，步驟如下：
[0034] 1、樣品來自于天津市渤海石油鉆井平臺的輕質(zhì)原油。
[0035] 2、原油中微生物的富集：量取5mL輕質(zhì)原油加入盛有60mL無機鹽培養(yǎng)基的250mL 搖瓶中，黑色原油漂浮在上層，下層為無色透明液體。35°C恒溫振蕩培養(yǎng)，每天觀察搖瓶內(nèi) 培養(yǎng)液。大約一周后，下層無色透明液體變?yōu)闇啙岬淖厣煽吹皆托∫旱螒腋≡跓o機鹽 培養(yǎng)液中，靜置后原油液滴即匯集到上層。無色透明培養(yǎng)基變渾濁說明細菌大量生長，由于 培養(yǎng)基中只含有原油一種碳源，因此細菌能夠利用原油生長；原油變成小液滴，說明細菌可 能能夠分泌表面活性劑等類似物質(zhì)，將疏水性的原油包埋在培養(yǎng)基中供細菌利用。
[0036] 3、菌株是否分泌鼠李糖脂的鑒定：吸取lmL培養(yǎng)一周后的培養(yǎng)液，用生理鹽水分 別稀釋10_ 2、10_4、10_6,隨后吸取100 y L稀釋液涂布在CTAB瓊脂平板上。37°C恒溫培養(yǎng)后， 平板上生長出了形態(tài)均一的菌落，且菌落周圍都存在一個深藍色的暈圈。
[0037] 4、菌株對不同碳氫化合物利用能力分析：以細菌的增長數(shù)量表征分離菌株對碳氫 化合物的利用能力。將分離菌D1分別接種到含5g/L不同碳氫化合物（柴油、正己烷、液 體石蠟、原油、菜籽油、甘油）的發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C、200r/min振蕩培養(yǎng)。每24h取樣，用 生理鹽水稀釋合適倍數(shù)后涂布在LB平板上培養(yǎng)并計數(shù)，計算出發(fā)酵液中細菌的濃度（cfu/ mL)。
[0038] 5、原油降解效率的測定：將原油溶解在石油醚（沸程30-60°C )中，其在紫外波長 處的吸光度與原油濃度成正比，可以根據(jù)其吸光度值定量分析石油的濃度。將分離菌株D1 接種在原油培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，每2d取出樣品分析剩余原油濃度。測定方法為在培養(yǎng)基中 加入等體積石油醚充分振蕩，使原油溶解在石油醚中，測定溶液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線 換算出原油濃度。采用此方法測定原油的降解曲線，進一步地，在原油培養(yǎng)基中添加少量甘 油，分析甘油對原油降解的作用。
[0039] 6、分離菌株的菌種鑒定：
[0040] (1) DNA提取方法：苯酚-氯仿-異戊醇抽提法。
[0041] (2) 16S rRNA 引物：正向引物：5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'（E. coli bases 8to 27)，反向引物：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'（E. coli bases 1507tol492)，由北京六合華大基 因科技股份有限公司合成。
[0042] (3)PCR 反應(yīng)體系：10XReaction Buffer 5. 0 y L，dNTP(2. 5mmol/L)4. 0 y L，正向 引物（10以111〇1/1)1.0 1^，反向引物（10 11111〇1/1)1.0 1^，丁&9聚合酶（5。/1^)0.8 1^，0150 1 y L，模版 DNA (50ng/ y L) 2. 0 y L，補加重蒸水至 50 y L。
[0043] (4)PCR 擴增程序：94°C 5min ;94°C lmin，51°C lmin，72°C 1. 5min，30 個循環(huán)； 72〇C lOmin ；4°C 2h〇
[0044] (5)數(shù)據(jù)處理：純化PCR產(chǎn)物并測序，使用NCBI Blast分析分離菌株