的同源性，并 使用MEGA5. 0作菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。
[0045] 本發(fā)明通過該方法從原油中直接篩選到一株細(xì)菌P. aeruginosa D1，具有分泌鼠 李糖脂和降解原油能力。其中，利用30g/L甘油和菜籽油發(fā)酵能得到11.5g/L和18.4g/L 鼠李糖脂。菌株D1具有利用原油和柴油生長(zhǎng)的能力，經(jīng)過5d的培養(yǎng)，細(xì)菌的濃度分別增加 到了 4. 7X 109和4. 0X 10 9cfu/mL。將P. aeruginosa D1接種到1. Og/L的原油培養(yǎng)基中培 養(yǎng)10d，原油濃度下降到了 0. 60g/L，在原油培養(yǎng)基中添加0. 5g/L的甘油，將原油濃度下降 到了 0. 22g/L。所篩選到的P. aeruginosa D1在生物修復(fù)方面具有較好的應(yīng)用潛力，且限量 甘油的添加能顯著提高石油降解效率。
[0046] 采用上述方法篩選保藏編號(hào)為CGMCC No. 10287的原油降解菌株，步驟中用到的相 關(guān)培養(yǎng)基、設(shè)備和方法敘述如下：
[0047] -、降解原油菌株的富集和分離
[0048] 所用試劑均為市售分析純或生化試劑；
[0049] 所使用的儀器主要包括：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；
[0050] 所用培養(yǎng)基：
[0051]無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl lg/L、KCl lg/L、NaN03 6g/L、KH2P04 3g/L、Na2HP04g/L 0? 3、 1%504 2.5§/1、0&(：121§/1、微量元素溶液1111171，培養(yǎng)基的口11為6.8，微量元素溶液配方為 ： FeCl3 0.16g/L、ZnS04 1.5g/L、CuS04 0.15g/L、MnS04 1.5g/L、H3B03 1.5g/L;
[0052] CTAB 瓊脂平板培養(yǎng)基：KH2P04 0? 7g/L、Na2HP04 0? 9g/L、NaN03 2g/L、MgS04 0? 4g/ L、CaCl2 0. lg/L、甘油 20g/L、CTAB 0. 2g/L、亞甲基藍(lán) 0. 005g/L、微量元素母液 lmL/L、瓊脂 粉 15g/L ;
[0053] LB 培養(yǎng)基：NaCl 10g/L，蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，pH 7.0，lX105Pa、121°C，滅 菌20min〇
[0054] 富集和分離步驟如下：
[0055] 向無菌無機(jī)鹽培養(yǎng)基中添加5mL原油，37°C搖床培養(yǎng)。待搖瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基變渾濁后 取樣用生理鹽水（0. 9 % NaCl)稀釋后涂布在CTAB-亞甲基藍(lán)瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)。選擇在 CTAB瓊脂平板上菌落周圍出現(xiàn)深藍(lán)色暈圈最大的菌株，三區(qū)劃線純化后保存，命名為D1。
[0056]結(jié)果：
[0057] 大約一周后，下層無色透明液體變?yōu)闇啙岬淖厣煽吹皆托∫旱螒腋≡跓o機(jī) 鹽培養(yǎng)液中，靜置后原油液滴即匯集到上層。吸取lmL培養(yǎng)一周后的培養(yǎng)液，用生理鹽水分 別稀釋10_ 2、10_4、10_6,隨后吸取100 y L稀釋液涂布在CTAB瓊脂平板上。37°C恒溫培養(yǎng)后， 平板上生長(zhǎng)出了形態(tài)均一的菌落，且菌落周圍都存在一個(gè)深藍(lán)色的暈圈。圖1為1(T 6稀釋液 在平板上的形態(tài)。挑選一個(gè)菌落三區(qū)劃線純化并保存，命名為D1，分類名稱為Pseudomonas aeruginosa，保藏編號(hào)為：CGMCC No. 10287,保藏日期：2015年01月07日，北京市朝陽區(qū)北 辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。
[0058] 二、篩選菌株D1鼠李糖脂生產(chǎn)能力分析
[0059] 所用試劑均為市售分析純或生化試劑；
[0060] 所使用的儀器主要包括：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；
[0061]所用培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基：NaCl 10g/L，蛋白胨10g/L，，酵母粉5g/L，pH 7.0， 1\10節(jié)&、121°〇，滅菌2〇1^11。
[0062]發(fā)酵培養(yǎng)基：菜籽油或甘油 30g/L、NaCl lg/L、KC1 lg/L、NaN036g/L、KH2P04 3g/ 1、似2冊(cè)0成/10.3、1%504 2.58/1、0&(：12 18/1、微量元素溶液1111171，培養(yǎng)基的口11為6.8， 微量元素溶液配方為：FeCl3 0? 16g/L、ZnS04 1. 5g/L、CuS04 0? 15g/L、MnS04 1. 5g/L、H3B03 1. 5g/L ；
[0063] 鼠李糖脂生產(chǎn)能力分析步驟如下：
[0064] 將所篩選到菌接D1到5mL LB培養(yǎng)基中置于37°C過夜培養(yǎng)，然后將每株菌按3% 的接種量分別接種到兩種發(fā)酵培養(yǎng)基中，35°C、200r/min振蕩培養(yǎng)72h。將發(fā)酵液12000r/ min離心10min，上清液稀釋合適的倍數(shù)后取1. 25mL稀釋液與2. 5mL蒽酮硫酸溶液于冰浴 中混合，并沸水浴15min使反應(yīng)完全，待溫度降到室溫左右測(cè)定反應(yīng)液在625nm下的吸光度 值。測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值（〇D625)，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線公式后計(jì)算出鼠李糖的濃度并乘以換算 指數(shù)3. 4算出鼠李糖脂含量。
[0065] 觀察結(jié)果：
[0066] 在搖瓶水平分別以甘油和菜籽油為碳源對(duì)菌株D1進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)鼠李糖脂分析。將 菌株D1分別接種到含30g/L菜籽油或甘油的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37°C發(fā)酵72h后分別測(cè)定鼠 李糖脂產(chǎn)量。以甘油為碳源發(fā)酵后得到了 11. 5g/L鼠李糖脂，而以菜籽油為碳源發(fā)酵后獲 得了 18. 4g/L鼠李糖脂，將產(chǎn)量提高了 60. 0%。
[0067] 三、篩選菌株D1對(duì)碳?xì)浠衔锢媚芰Ψ治?br>[0068]所用試劑均為市售分析純或生化試劑；
[0069] 所使用的儀器主要包括：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；
[0070] 所用培養(yǎng)基：
[0071] LB 培養(yǎng)基：NaCl 10g/L，蛋白胨 10g/L，酵母粉 5g/L，pH 7.0，lX105Pa、121°C，滅 菌 20min ;
[0072]無機(jī)鹽培養(yǎng)基：NaCl lg/L、KCl lg/L、NaN03 6g/L、KH2P04 3g/L、Na2HP04g/L 0? 3、 1%504 2.5§/1、0&(：121§/1、微量元素溶液1111171，培養(yǎng)基的口11為6.8，微量元素溶液配方為 ： FeCl3 0.16g/L、ZnS04 1.5g/L、CuS04 0.15g/L、MnS04 1.5g/L、H3B03 1.5g/L;
[0073] 細(xì)菌對(duì)碳?xì)浠衔锢媚芰Ψ治霾襟E如下：
[0074] 實(shí)驗(yàn)以細(xì)菌的增長(zhǎng)數(shù)量表征分離菌株對(duì)碳?xì)浠衔锏睦媚芰?。將分離菌D1分 別接種到含5g/L不同碳?xì)浠衔铮ú裼?、正己烷、液體石蠟、原油、菜籽油、甘油）的發(fā)酵培 養(yǎng)基中，35°C、200r/min振蕩培養(yǎng)。每24h取樣，用生理鹽水稀釋合適倍數(shù)后涂布在LB平板 上培養(yǎng)并計(jì)數(shù)，計(jì)算出發(fā)酵液中細(xì)菌的濃度（cfu/mL)。
[0075] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
[0076] 將過夜培養(yǎng)的P. aeruginosa D1種子液接種到含不同碳?xì)浠衔锏囊后w培養(yǎng)基 中，35°C振蕩培養(yǎng)5d。每天取樣稀釋后涂布LB平板，通過菌落計(jì)數(shù)法計(jì)算培養(yǎng)液中細(xì)菌的 濃度。以細(xì)菌數(shù)（cfu/mL)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)做細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，如圖5。由圖可以看 出，P. aeruginosa D1對(duì)原油、柴油具有較強(qiáng)的利用能力，經(jīng)過5d的培養(yǎng)，細(xì)菌數(shù)分別增加 到了原來的39. 2倍和33. 9倍。
[0077]四、原油降解效率的測(cè)定
[0078] 所用試劑均為市售分析純或生化試劑；
[0079] 所使用的儀器主要包括：恒溫?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱；
[0080] 所用培養(yǎng)基：
[0081]原油培養(yǎng)基：原油 lg/L、NaCl lg/L、KCl lg/L、NaN03 6g/L、KH2P04 3g/L、Na2HP04g/ L 0. 3、MgS04 2. 5g/L、CaCl2 lg/L、微量元素溶液lmL/L，培養(yǎng)基的pH為6. 8,微量元素溶液 配方為：FeCl3 0? 16g/L、ZnS04 1. 5g/L、CuS04 0? 15g/L、MnS04 1. 5g/L、H3B03 1. 5g/L ;
[0082] 原油降解效率分析方法：
[0083] 將原油溶解在石油醚（沸程30-60°C )中，其在紫外波長(zhǎng)處的吸光度與原油濃度成 正比，可以根據(jù)其吸光度值定量分析石油的濃度。將分離菌株D1接種在原油培養(yǎng)基中振蕩 培養(yǎng)，每2d取出樣品分析剩余原油濃度。測(cè)定方法為在培養(yǎng)基中加入等體積石油醚充分振 蕩，使原油溶解在石油醚中，測(cè)定溶液的吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出原油濃度。采用此 方法測(cè)定原油的降解曲線，進(jìn)一步地，在原油培養(yǎng)基中添加少量甘油，分析甘油對(duì)原油降解 的作用。
[0084]結(jié)果：
[0085] 將P. aeruginosa D1接種到含原油lg/L的無機(jī)鹽培養(yǎng)中，35°C，200r/min培養(yǎng)。 每2d取樣測(cè)定培養(yǎng)基原油濃度。以原油濃度為縱坐標(biāo)，分解時(shí)間為橫坐標(biāo)作得圖。結(jié)果顯 示，經(jīng)過12d的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中的原油濃度從0. 78g/L下降到了 0. 6g/L