蛋白綴合物的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】蛋白綴合物 發(fā)明領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及適于產(chǎn)生具有改進(jìn)的血漿半衰期的藥物的綴合肽的領(lǐng)域。特別地，本 發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)由微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase)的酶促反應(yīng)獲得的綴合蛋白、和用于 制備高度純的綴合蛋白的改進(jìn)的方法，所述高度純的綴合蛋白沒(méi)有產(chǎn)物衍生的降解并且呈 現(xiàn)出改進(jìn)的儲(chǔ)存期。 現(xiàn)有技術(shù)
[0002] 與生物相容的、高分子量的聚合物綴合是用于增加治療肽或蛋白的半衰期和用于 改進(jìn)其持久性效果的最常用技術(shù)之一。特別地，在已經(jīng)被廣泛利用的所謂的聚乙二醇化反 應(yīng)中，將選擇的蛋白共價(jià)地結(jié)合至具有從1，000-2, 000道爾頓（Da)至20, 000-40, OOODa或 甚至更高的分子量的一種或更多種線(xiàn)性的或支化的聚乙二醇（PEG)鏈。通常，聚乙二醇化 蛋白示出較低的腎清除率、以及較高的穩(wěn)定性和減少的免疫原性。當(dāng)多肽與PEG合適地結(jié) 合時(shí)，其流體力學(xué)體積增加并且其物理化學(xué)性質(zhì)被修改，而諸如體外活性或受體識(shí)別的基 本的生物學(xué)功能可以保持不變、經(jīng)歷減少或在一些情況下完全被根除。PEG綴合掩蔽了蛋 白表面并且增加其表觀(guān)分子尺寸，因此減小腎超濾，防止與抗體或抗原呈遞細(xì)胞（antigen processing cell)相互作用并且減少蛋白水解降解。最后，PEG綴合向聚乙二醇化分子賦 予其物理化學(xué)性質(zhì)并且因此肽和非肽藥物生物分布和溶解度也被修改。用于蛋白綴合的另 一選擇（作為PEG的替代方案）是利用其它線(xiàn)性的或支化的生物相容性聚合物，諸如例如 右旋糖酐、聚（乙烯吡咯烷酮）、聚（丙烯酰嗎啉）、聚多糖等等。
[0003] 聚乙二醇化通常通過(guò)氨基酸反應(yīng)性側(cè)鏈和合適地官能化的甲氧基-PEG(m-PEG) 之間的化學(xué)反應(yīng)來(lái)進(jìn)行。
[0004] 通常利用的化學(xué)聚乙二醇化技術(shù)在以下出版物中描述：
[0005] -S. Zalipsky,Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev. , 16?157-182?1995 ；
[0006] -F. M. Veronese, Peptide and Protein PEGylatioma Review of Problems and Solutions，Biomaterials，22,405-417, 2001。
[0007] -S. Jevsevar, M. Kunstel j, V. G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins，Biotechnol. J. 5,113 - 128, 2010。
[0008] 除了化學(xué)聚乙二醇化之外，結(jié)合m-PEG鏈和蛋白的酶促程序已經(jīng)被描述。例如， 這些基于利用原核和真核起源兩者的谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶類(lèi)以催化將用伯氨基官能化的m-PEG 轉(zhuǎn)移至感興趣的多肽鏈中天然存在的或通過(guò)位點(diǎn)特異性誘變反應(yīng)插入的谷氨酰胺殘基的 酉先基（H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of ProteinsjAdv. Drug Deliv. Rev.，54,487-504, 2002) 〇
[0009] 例如，EP785276和US6010871二者描述使用微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase)將 聚合物鏈連接至在其氨基酸序列中具有至少一個(gè)谷氨酰胺殘基的肽和蛋白。在這些專(zhuān)利 中，盡管給出了在一些模型蛋白上的單取代的實(shí)例，但不清楚的是取代是否也是位點(diǎn)特異 性，這意指它們產(chǎn)生單分子形式或位置異構(gòu)體的混合物，在位置異構(gòu)體的混合物中，盡管被 單取代，聚合物鏈與不同的谷氨酰胺結(jié)合。
[0010] 在另一方面，EP2049566和US7893019二者公開(kāi)通過(guò)使用MTGase的酶促反應(yīng)在谷 氨酰胺135處選擇性地單聚乙二醇化的新的G-CSF類(lèi)似物。
[0011] 然而，上文報(bào)道的專(zhuān)利和論文中不重視由酶促反應(yīng)產(chǎn)生的聚乙二醇化產(chǎn)物的純化 方法，特別地考慮到產(chǎn)物中污染性的殘余的MTGase的量，所述殘余的MTGase意外地仍然能 夠水解綴合的PEG分子并且產(chǎn)生產(chǎn)物衍生的異質(zhì)性。
[0012] 正日益感到對(duì)開(kāi)發(fā)允許維持穩(wěn)定的治療性蛋白（therapeutic protein)的方法的 需求和重要性。
[0013] 因此，本發(fā)明的目的是開(kāi)發(fā)允許減少在綴合反應(yīng)之后存在并且在其儲(chǔ)存期間降解 綴合的藥物的殘余的MTGase污染物的方法。
[0014] 發(fā)明概述
[0015] 本發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)由微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase)的酶促反應(yīng)獲得的綴合蛋 白，其特征在于以下事實(shí)：在純化的產(chǎn)物中殘余的MTGase的含量不高于3p. p. m，所述綴合 蛋白在2°C至8°C范圍內(nèi)的溫度下呈現(xiàn)出至少36個(gè)月的儲(chǔ)存期。
[0016] 在另外的方面中，本發(fā)明涉及用于通過(guò)陽(yáng)離子交換色譜法純化通過(guò)經(jīng)由谷氨酰胺 轉(zhuǎn)移酶的酶促反應(yīng)獲得的綴合蛋白的方法。
[0017] 如將在發(fā)明詳述中另外描述的，本發(fā)明的方法具有允許獲得高度純的綴合的治療 性蛋白的優(yōu)點(diǎn)。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，用于純化綴合蛋白的方法包括以下的步驟：
[0019] a.使陽(yáng)離子交換色譜柱達(dá)到小于4的pH;
[0020] b.將色譜柱裝載有在步驟a.的柱上具有小于4的pH的含有聚乙二醇化蛋白的反 應(yīng)混合物；
[0021] c.將步驟b.的色譜柱用具有小于4的pH的洗脫劑洗脫，
[0022] 從而收集含有具有低于或等于綴合蛋白的總量的3ppm的殘余的微生物谷氨酰胺 轉(zhuǎn)移酶含量的綴合蛋白的級(jí)分（fraction)，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內(nèi)的溫度下 呈現(xiàn)出至少36個(gè)月的儲(chǔ)存期。
[0023] 本發(fā)明的另外的方面是通過(guò)本文描述的方法可獲得的綴合蛋白和包含所述綴合 蛋白和藥學(xué)上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0024] 附圖簡(jiǎn)述
[0025] 從下文報(bào)道的詳細(xì)描述、從被給出用于例證性和非限制性的目的的實(shí)施例以及從 所附的圖1-8中，本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)將是明顯的，其中：
[0026] 圖1:示出MTGase的RP-HPLC熒光測(cè)定。MTGase的RP-HPLC熒光測(cè)定。校正曲線(xiàn) (a)和在7. 3min時(shí)熒光底物CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS從在8.Omin時(shí)熒光產(chǎn)物CBZ-Gln(Gly-CAD-DNS) -Q-NH-CH2-CH2-0-Me的RP-HPLC分離（b)。
[0027] 圖2:示出在MTGase存在下在約30min后（a)和在16小時(shí)后（b)的Met-G-CSF和 mPEG-NH2 20kDa的反應(yīng)混合物的SE-HPLC色譜圖，所述色譜圖示出Met-G-CSF(以11. 5min 的保留時(shí)間洗脫）被聚乙二醇化以給出Met-G-CSF-Glnl35-PEG 20kDa(保留時(shí)間7. 9min)。 在13min洗脫的峰是由于溶劑前沿。
[0028] 圖3:示出在pH 5下MTGase從Macrocap SP柱的洗脫圖。
[0029] 圖4:示出在pH 5下聚乙二醇化Met-G-CSF和MTGase從Macrocap SP柱的洗脫 圖。
[0030] 圖5:示出在MTGase分離級(jí)分26-40 (a)中和在聚乙二醇化Met-GCSF+MTGase級(jí) 分21-58 (b)和級(jí)分66-75 (c)中的殘余的MTGase的RP-HPLC熒光測(cè)定。
[0031] 圖6 :示出在50ppm的MTGase存在下在5°C下儲(chǔ)存1個(gè)月之前（a)和之后（b)的 純化的 r-Met-G-CSF-Q135-PEG 20kDa 的 IE-HPLC。Met-G-CSF 在 7. 5-8. Imin 洗脫的畸峰 是由于溶劑前沿洗脫的假象。
[0032] 圖7 :示出在室溫下用50ppm的MTGase處理L 5小時(shí)之前（a)和之后（b)的純化 的 r-Met-G-CSF 的 IE-HPLC。
[0033] 圖8:示出通過(guò)TGase介導(dǎo)的聚乙二醇化產(chǎn)生并且通過(guò)在不同pH下的陽(yáng)離子交換 色譜法純化的Met-G-CSF-Glnl35-PEG的穩(wěn)定性數(shù)據(jù)。
[0034] 發(fā)明詳述
[0035] 本發(fā)明涉及通過(guò)經(jīng)由微生物谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶（MTGase)的酶促反應(yīng)獲得的綴合 蛋白，其特征在于以下事實(shí)：在純化的產(chǎn)物中殘余的MTGase的含量不高于5p. p. m、優(yōu)選地 3p. p. m，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內(nèi)的溫度下呈現(xiàn)出至少24個(gè)月、優(yōu)選地至少36 個(gè)月的儲(chǔ)存期。