下的陽離子交換色譜法從污染性的酶MTGase純化使谷氨酰胺135上的酰胺鍵酶促地單聚 乙二醇化的Met-G-CSF(非格司亭）以便在綴合的生物藥物的儲存期期間消除任何明顯的 脫酰胺化的方法的以下實施例。 實施例
[0073] 實施例1.
[0074] 以下實施例中使用的MTGase制劑來自商業(yè)上的酶的各個批次（Activa WM, Ajinomoto)，所述商業(yè)上的酶如由 Scaramuzza 等人（J. Control Rel. 164, 355-363， 2012)描述的部分地純化至當通過根據(jù)Folk和Cole的方法（J. Biol. Chem. 241，5518-5525,1966)以N-a -芐氧羰基-L-谷氨酰胺?；?甘氨酸（N-CBZ-Gln-Gly)和羥胺作為底 物的比色的異羥肟酸程序測定時，酶活性不低于30單位/mg蛋白。
[0075] Met-G-CSF-Glnl35-PEG20kDa中的殘余的MTGase的宙量
[0076] 在百萬分率（ppm)水平下確定污染聚乙二醇化Met-G-CSF的MTGase通過 由 Pasternack R.等人描述的方法（Anal. Biochem. 249, 54 - 60,1997)的修改評估 殘余的MTGase污染物來進行。簡要地，I-N-(芐氧羰基-L-谷氨酰胺?；?甘氨酰 基）-5-N-(5' -N'，N'-二甲基氨基-1'-萘磺?；?二氨基戊烷（Z-Gln-Gly-CAD-DNS) 被用作MTGase底物，在CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS的谷氨酰胺和2-甲氧基乙胺（MED)的氨基 之間形成熒光的綴合產(chǎn)物。用于校正曲線的五種溶液通過將30 yl的在DMSO/水（9:1)中 的 2. 6mg/ml CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS 與 20 y 1 的 I. 7mg/ml MED 含水溶液、10 y 1 的 DMSO 和 20 y 1的Tris-HCl-pH 8. 0緩沖液混合來制備。將100 y I MTGase標準含水溶液（分別地 40、100、200、400和800ng/ml)添加至每種溶液。
[0077] 樣品溶液如校正溶液地制備，除了添加100yI(200ng/ml)聚乙二醇化Met-G-CSF 溶液而不是標準MTGase溶液之外。
[0078] 樣品和參考溶液在37°C下溫育22小時并且反應通過添加100 y 1乙腈停止。
[0079] 在離心后，樣品的上清液和標準溶液通過在用乙腈40% - 90%、H2060%- 10% 的15分鐘梯度以0. 5ml/min流速洗脫的裝備有熒光測定檢測器（在335nm下激發(fā)，在550nm 下發(fā)射）的Hypersyl C18, 5 ym，250x 4. 6mm內徑柱上的RP-HPLC分析。綴合產(chǎn)物的保留 時間是約8. 0分鐘，而反應物（CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS)的保留時間是約7. 3分鐘。
[0080] 定量通過在通過用不同量的標準MTGase溫育CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS和2-甲氧基 乙胺獲得的校正曲線上內推樣品溶液中的CBZ-Gln(Gly-CAD-DNS)-Q-NH-CH2-CH2-0-Me的 面積來進行。表1示出雙份標準溶液的峰面積，同時圖1報告標準溶液的酶促反應的底物 和產(chǎn)物的典型的HPLC分離連同獲得的校正曲線。
[0081] 轟丄.MTGase標準溶液的RP-HPLC熒光測定。
[0082]
【主權項】
1. 一種綴合蛋白，所述綴合蛋白通過由微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)催化的酶促 反應獲得，其特征在于以下事實：在純化的產(chǎn)物中殘余的MTGase含量不高于5p. p. m，所述 綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現(xiàn)出至少24個月的儲存期。
2. 根據(jù)權利要求1所述的綴合蛋白，其特征在于以下事實：在所述純化的產(chǎn)物中所述 殘余的MTGase含量不高于3p. p. m，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現(xiàn)出至 少36個月的儲存期。
3. 根據(jù)權利要求1或2中任一項所述的綴合蛋白，所述綴合蛋白通過在治療性蛋白和 親水性聚合物優(yōu)選地親水性非免疫原性聚合物之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的酶 促反應獲得。
4. 根據(jù)權利要求3所述的綴合蛋白，其中所述治療性蛋白選自由Met-G-CSF、G-CSF、 GM-CSF、h-GH、干擾素、白細胞介素、Fab和scFv抗體片段、胰高血糖素、GLP-1、胰島素和其 衍生物以及類似物組成的組。
5. 根據(jù)權利要求3所述的綴合蛋白，其中所述親水性非免疫原性聚合物選自由聚乙二 醇、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯吡咯烷酮和羥乙基淀粉組成的組。
6. 根據(jù)權利要求3所述的綴合蛋白，所述綴合蛋白通過在Met-G-CSF和氨基-聚乙二 醇之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的酶促反應獲得。
7. 用于通過陽離子交換色譜法純化綴合蛋白的方法，所述綴合蛋白通過經(jīng)由谷氨酰胺 轉移酶的酶促反應獲得，所述方法包括以下的步驟： a. 使陽離子交換色譜柱達到小于4的pH ; b. 將所述色譜柱裝載有在步驟a.的所述柱上具有小于4的pH的含有所述綴合蛋白的 反應混合物； c. 將步驟b.的所述色譜柱用具有小于4的pH的洗脫劑洗脫， 從而收集含有具有低于或等于所述綴合蛋白的總量的3ppm的殘余的微生物谷氨酰胺 轉移酶含量的所述綴合蛋白的級分，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現(xiàn)出 至少36個月的儲存期。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中所述步驟a.、b.和c.的pH是在從3至3. 9的范 圍內，優(yōu)選地pH 3. 8,并且其中所述步驟a.和b.的pH用乙酸鹽緩沖液，優(yōu)選地30mM乙酸 鹽緩沖液獲得。
9. 根據(jù)權利要求7或8中任一項所述的方法，其中所述步驟c.的pH用乙酸鹽緩沖液， 優(yōu)選地200mM乙酸鹽緩沖液獲得。
10. 根據(jù)權利要求7至9中任一項所述的方法，其中在所述裝載步驟b.之后，將所述 色譜柱用以所述色譜柱的體積的4倍的體積的乙酸鹽緩沖液，優(yōu)選地30mM乙酸鹽緩沖液洗 滌。
11. 根據(jù)權利要求7至10中任一項所述的方法，其中步驟b.的所述反應混合物通過在 治療性蛋白和親水性聚合物優(yōu)選地親水性非免疫原性聚合物之間的由微生物谷氨酰胺轉 移酶催化的酶促反應獲得。
12. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述治療性蛋白選自由Met-G-CSF、G-CSF、 GM-CSF、h-GH、干擾素、白細胞介素、Fab和scFv抗體片段、胰高血糖素、GLP-1、胰島素和其 衍生物以及類似物組成的組。
13. 根據(jù)權利要求11所述的方法，其中所述親水性非免疫原性聚合物選自由聚乙二 醇、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯吡咯烷酮和羥乙基淀粉組成的組。
14. 根據(jù)權利要求7至10中任一項所述的方法，其中所述綴合蛋白通過在Met-G-CSF 和氨基-聚乙二醇之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的酶促反應獲得。
15. 根據(jù)權利要求7至14中任一項所述的方法，其中所述綴合蛋白在5°C的溫度下呈 現(xiàn)出至少36個月的儲存期。
16. 根據(jù)權利要求7至14中任一項所述的方法，其中所述綴合蛋白在5°C的溫度下呈 現(xiàn)出至少36個月的儲存期。
17. -種通過根據(jù)權利要求7至16中任一項的在小于4的pH下的陽離子交換色譜方 法可獲得的綴合蛋白，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現(xiàn)出至少36個月的 儲存期。
18. -種藥物組合物，所述藥物組合物包含根據(jù)權利要求17所述的綴合蛋白、以及藥 學上可接受的賦形劑。
【專利摘要】本發(fā)明涉及適于產(chǎn)生具有改進的血漿半衰期的藥物的綴合肽的領域。特別地，本發(fā)明涉及通過經(jīng)由微生物谷氨酰胺轉移酶(MTGase)的酶促反應獲得的綴合蛋白、和用于從肽或重組蛋白移除殘余的谷氨酰胺轉移酶的改進的方法，所述肽或重組蛋白通過微生物谷氨酰胺轉移酶(MTGase)在谷氨酰胺側鏈處經(jīng)過酰胺鍵合酶促地綴合至親水性非免疫原性聚合物，允許獲得純化的綴合肽或蛋白，所述純化的綴合肽或蛋白對肽或蛋白部分和親水性聚合物之間的酰胺鍵的酶促水解是穩(wěn)定的，并且沒有產(chǎn)物衍生的降解，展示了藥物所需的穩(wěn)定性。
【IPC分類】A61K47-48, C07K1-18
【公開號】CN104837856
【申請?zhí)枴緾N201380064408
【發(fā)明人】詹卡洛·托農(nóng), 加埃塔諾·奧爾西尼, 魯?shù)婪颉な├灼辗茽?
【申請人】拜歐-克爾有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請日】2013年12月10日
【公告號】WO2014090789A1