環(huán)境水體致基因突變的遺傳毒性檢測技術(shù)及應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及環(huán)境科學和健康風險評價領(lǐng)域，是檢測環(huán)境樣品遺傳毒性的高通量實 驗方法，是通過改進的SOS/umu實驗檢測環(huán)境水體樣品致基因突變能力大小的方法及其應 用。
【背景技術(shù)】
[0002] 環(huán)境水體樣品綜合遺傳毒性檢測可以了解環(huán)境污染對人群健康的危害效應，是環(huán) 境健康綜合監(jiān)測中不可或缺的環(huán)節(jié)。傳統(tǒng)的環(huán)境監(jiān)測僅關(guān)注環(huán)境樣品的理化指標，如具體 污染物含量等，但無法回答其是否具有健康危害效應。且多種污染物共同存在時其綜合毒 性效應可能會發(fā)生改變。遺傳毒性依據(jù)其檢測原理不同有多種實驗方法，基因突變與腫瘤 等多種的發(fā)生相關(guān)是遺傳毒性檢測的重點研宄內(nèi)容之一。
[0003] 適用于檢測環(huán)境水體基因突變遺傳毒性的研宄方法有待進一步完善。以基因突變 為檢測終點的遺傳毒性實驗包括Ames試驗、TK基因突變試驗、SOS/umu實驗等。其中Ames 試驗是通過鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型（his-)菌株在受試物的作用下回復突變 的能力大小進行檢測的。其操作步驟較為簡單，應用比較廣泛，但需要進行大量細菌的培 養(yǎng)，給實驗造成一定難度。TK基因突變實驗是利用哺乳動物體細胞基因正向突變的試驗，細 胞在受試物的作用下若能夠引起TK基因突變，則在三氟苷（TFT)等嘧啶類似物的存在下細 胞依然能夠存活，否則細胞死亡。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色 體異倍型和其他較大范圍基因組改變在內(nèi)的多種遺傳改變，但在實際應用中，使用該方法 檢測基因突變能力前為排除自發(fā)突變產(chǎn)生的tk+細胞，需對細胞進行4天的預培養(yǎng)，耗時 較長；另在實驗開始前還需進行預實驗確定合適的染毒濃度，這使得該方法在實際應用中 較為復雜。SOSAimu實驗是基于DNA損傷物誘導S0S反應而表達umuC基因的能力。正常情 況下，生物體內(nèi)的修復蛋白的mRNA合成受到阻遏蛋白LexA的抑制，表達量較低。當DNA兩 條鏈的都有損傷且損傷不能被修復時，細胞或細菌會進行S0S修復。S0S修復激活RecA蛋 白介導LexA蛋白裂解，使S0S相關(guān)基因umuC、umuD等大量表達。在鼠傷寒沙門菌TA1535 中導入攜帶umuC"LacZ嵌合體的質(zhì)粒pSK1002,當細菌受誘變物作用引起S0S反應時，激活 umuCT'LacZ融合基因，表達出有0 -半乳糖甘酶活性的融合蛋白，通過檢測此酶的活性可以 確定受試物引起DNA損傷的程度，若加入S9混合液，則可以檢測化學物是否經(jīng)代謝活化生 成損害DNA的產(chǎn)物。SOS/umu實驗操作簡單，結(jié)果準確，在環(huán)境水體遺傳毒性檢測中已有一 定程度的應用，但現(xiàn)有的實驗方法仍存在一定不足之處。SOS/umu實驗中為保證實驗結(jié)果 的準確性，一個樣品通常設(shè)定5-6個濃度梯度，并設(shè)3個重復樣，導致實驗組較多，工作量較 大，使其在大規(guī)模的環(huán)境水體遺傳毒性綜合監(jiān)測中的應用帶來不便。
[0004] 改進后的SOS/umu實驗可用于環(huán)境水體遺傳毒性監(jiān)測，提高實驗效率。本發(fā)明對 現(xiàn)有的SOS/umu實驗進行了實驗方法方面的改進，通過使用96孔微孔板，簡化了實驗流程， 并可同時進行多個樣品的遺傳毒性測試工作，提高檢測效率。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種改進后的SOS/umu高通量檢測方法，所述方法選用96孔微孔板作 為反應容器，在實驗操作時一個96孔板可同時測定4個樣品，且96孔板操作方便快捷，可 提高檢測通量，能夠滿足大量的環(huán)境水體樣品遺傳毒性監(jiān)測的需求。
[0006] 本發(fā)明所述的SOS/umu實驗方法包括水樣前處理、染毒、結(jié)果檢測以及結(jié)果分析 等內(nèi)容。
[0007] 1水樣前處理
[0008] (1)活化濾膜：使用活化后的0. 45 y m的玻璃纖維濾膜過濾水樣，去除水樣中粒徑 較大的雜質(zhì)?；罨椒椋菏褂民R弗爐將0. 45 ym的玻璃纖維濾膜（GF/A，70mm，Whatman) 于450°C _500°C溫度下活化3h，活化后放在干燥器中室溫平衡24h以上，使用前l(fā)h用超純 水再活化；
[0009] (2)HLB固相萃取柱活化：使用HLB固相萃取柱（Waters Oasis，6mL)富集水體中 的有機物等，用于遺傳毒性檢測。每根HLB固相萃取柱先用6mL二氯甲烷浸泡5min，然后使 溶液緩慢流出，待液面與上層濾板平行后，關(guān)上閘門，加入6mL甲醇，使二氯甲烷溶液完全 流出后再關(guān)上閘門，之后加入6mL超純水使之緩慢流出，最后柱內(nèi)留有少量超純水；
[0010] (3)過濾：待泥沙沉淀之后，再進行過濾。將0. 45 y m的玻璃纖維濾膜放于砂芯過 濾裝置對應位置，砂芯過濾裝置連接真空泵（1500MA)進行過濾，過濾后的水樣用潤洗干凈 的棕色玻璃瓶保存。
[0011] (4)水樣過柱：將HLB固相萃取柱安置在固相萃取儀頂端接口處，固相萃取柱頂端 與大流量采樣器相連，將采樣器的采樣頭放置于裝有過濾后的水樣的玻璃瓶中；將固相萃 取儀與抽濾瓶和真空泵連接，打開真空泵并小心開啟固相萃取儀的閥門，調(diào)節(jié)每根柱子的 流量，流速控制在6~8mL/min，每根HLB柱富集2L水樣。富集完成后用真空泵抽干部分柱 內(nèi)水分，用氮吹儀將柱子吹干，若不立即使用可在_20°C保存。
[0012] (5)樣品洗脫：在通風櫥內(nèi)，用10mL丙酮對HLB柱進行洗脫，使丙酮在無外力情況 下自然流下，洗脫液用50mL棕色玻璃瓶收集，殘留的丙酮用洗耳球吹下。丙酮可以稍微過 量一些，保證樣品洗脫液達到10mL。
[0013] (6)合并相同樣品：將相同樣品的洗脫液進行合并，首先對丙酮洗脫液進行氮吹 濃縮，剩余約200 y L后合并相同水樣至同一樣品管，將其它各管用少量丙酮沖洗3-4次，同 樣合并到同一樣品管中，用氮吹儀吹至完全干燥。
[0014] (7)按照1L水樣定容至10 y L濃縮液的比例用DMS0定容樣品，-20°C保存。
[0015] 2試劑及配制
[0016] (l)TGA增菌液：10g胰蛋白胨、5g氯化鈉，11. 9g輕乙基哌嘆硫磺酸，溶于980mL蒸 餾水中調(diào)pH為7. 0±0. 2,溶解2g葡葡糖到20mL蒸餾水中，分別高壓滅菌后，將滅菌后的溶 液混合，并在無菌條件下加入50mg氨芐青霉素，此溶液在-20°C保存4周。
[0017] (2) 10XTGA :(不加 S9 實驗）溶解胰蛋白胨 10g，NaCl 5g，HEPES 11. 9g 于 80mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH為7. 0±0. 2 ;溶解葡萄糖2g于20mL蒸餾水中，分別以121°C高壓20分 鐘滅菌；將滅菌后溶液混合，在無菌條件下加入50mg氨卞青霉素。（加S9實驗）溶解胰蛋 白胨 10g，NaCl 5g，KCl 2.46g，MgCl2.6H20 1.63g，HEPES 11.9g 于 80mL 蒸餾水中，調(diào)節(jié) PH 為7. 0±0. 2 ;溶解葡萄糖2g于20mL蒸餾水中，分別以121°C高壓20分鐘滅菌；將滅菌后溶 液混合，在無菌條件下加入50mg氨卞青霉素。
[0018] (3)磷酸鹽緩沖溶液：1. 086g Na2HP04.2H20 和 0? 538g NaH2P04 .H20 溶于 100mL 水 中，調(diào)pH為7. 0±0. 2,高壓滅菌。
[0019] (4)B-buffer 溶液：Na2HP04 ? 2H20 2. 018g，NaH2P04 ? H20 0? 55g，KC1 0? 075g， MgS047H20 0.025g，用lOOmL蒸餾水溶解，調(diào)pH為7.0±0.2,高壓滅菌后加入O.lg SDS，使 用前加入270 yL的巰基乙醇，在2-5°C冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>[0020] (5)輔助因子：臨用時溶解6-磷酸葡萄糖（G-6-P) 76mg、輔酶（NADP) 148mg于5mL 10 XTGA中，實驗操作需在冰上進行。
[0021] (6)4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQ0)用作不加S9陽性對照：溶解4-NQO 5mg于 5mLDMS0中，-20°C保存；臨用前用含30% DMS0的溶液稀釋2000倍。
[0022] (7) 2-氨基蒽（2-AA)用作加S9時的陽性對照：溶解2-AA 5mg于5mL DMS0, -20 °C 保存（避光）；臨用前用含30% DMS0的溶液稀釋500倍。
[0023] (8)二甲基亞砜（DMS0)為稀釋溶液和溶劑對照，配制成30%的水溶液。
[0024] (9)顯色劑鄰硝基苯半乳糖苷（0NPG)為酶反應底物：溶解0NPG 45mg于10mL磷 酸鹽緩沖液中（臨用前2h配置，避光）。
[0025] (10)碳酸鈉為酶反應阻斷液：Na2C03 10. 6g溶于100mL蒸餾水中，配制成lmol/L 的溶液，使用前20min配制以避免出現(xiàn)沉淀。
[0026] (11)十二烷基硫酸鈉（SDS)
[0027] (12)二氯甲烷、甲醇、丙酮、（均為HPLC級）
[0028] (13)氫氧化鈉：c(Na0H) = lmol/L 分析純
[0029] (14)鹽酸：c (HC1) = lmol/L 分析純
[0030] (15)純水：符合GB6682實驗室用水規(guī)格中一級水標準的水，即電導率彡0. 01 y s/ 〇11(25°〇，吸光度彡 0.001(25411111，1〇11光程），二氧化硅含量彡0.0111^/1
[0031] (16) S9:從酶誘導劑。
[0032] 注：
[0033] (1)2-氨基蒽在配置及儲存過程中同0NPG-樣，要嚴格避光。
[0034] (2)4_NQ0以及2-氨基蒽在實驗前用DMS0配制成lg/L的儲備液。前者在使用前 用DMS0/水（3 : 7)作2000倍稀釋；后者在使用前用DMS0/去離子水（3 : 7)作500倍稀 釋。
[0035](3)TGA和10XTGA中可以加入11. 9g的4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES)，可降低實 驗難度。
[0036] (4)在加 S9 的實驗中，10XTGA 中還要力卩入 2.46g KCl/100mL，1.63g MgCl2 ? 6H20/100mL ;使用前再向 5mL 溶液中力卩入 148mg NADP/5mL 10XTGA，76mg G-6-P/5mL10 X TGA，配制成含輔助因子的10 X TGA，注意操作需在冰上進行。
[0037] (5) S9不可以反復凍融，解凍過程要緩慢進行，加入到其它體系中前要振蕩均勻， 使用過程中需在冰上進行。
[0038] 3 SOS/u