mu 試驗(yàn)步驟
[0039] 大鼠肝臟微粒體酶系統(tǒng)（S9)作為體外代謝活化，實(shí)驗(yàn)分別在加和不加S9兩種情 況（+S9, -S9)下進(jìn)行。以下為不加S9時(shí)的實(shí)驗(yàn)步驟。
[0040] (1)細(xì)菌復(fù)蘇：
[0041] 接種鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA1535/pSK1002菌株：從-80°C冰箱中取出菌株，緩慢解凍 后混勻吸取100 yL原菌液加入到10mLTGA培養(yǎng)基中，150-180r/min，37°C ± 1 °C，振蕩孵育 過(guò)夜。第二天用TGA培養(yǎng)液10倍稀釋?zhuān)?7°C振蕩孵育1. 5-3h。
[0042] (2)細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)：
[0043] 實(shí)驗(yàn)前一天晚上按照復(fù)蘇過(guò)程接種菌株，第二天用TGA培養(yǎng)液10倍稀釋?zhuān)?7°C振 蕩孵育1. 5-3h，以TGA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定600nm(紫外光）處的細(xì)菌溶液吸光度在340 到350FNU之間，即測(cè)量值為0. 25-0. 3。此時(shí)，細(xì)菌處于指數(shù)生長(zhǎng)期，正適合實(shí)驗(yàn)要求，須盡 快進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0044] (3)染毒
[0045] 按照下面96孔微孔板示意圖所示對(duì)待測(cè)水樣的遺傳毒性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品最 高濃度為加入10 y L水樣濃縮液（相當(dāng)于1L水樣，S)，按照等體積稀釋的方法，依次設(shè)置濃 度梯度：S、1/2S、1/4S、1/8S、1/16S、1/32S。同時(shí)用去離子水作為空白對(duì)照，30% DMS0水溶 液作為陰性對(duì)照，〇. 5 y g/mL 4-NQ0作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
[0046]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種環(huán)境水體致基因突變的遺傳毒性高通量檢測(cè)方法，所述方法為改進(jìn)的SOS/umu 實(shí)驗(yàn)方法，具體包括水樣前處理、染毒、結(jié)果檢測(cè)以及結(jié)果分析等步驟。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其中具體步驟： (1) 環(huán)境水體樣品采集之后首先經(jīng)過(guò)〇. 45 y m玻璃纖維濾膜過(guò)濾、HLB固相萃取柱富集 以及丙酮洗脫、合并，以及干燥等具體前處理步驟； (2) 實(shí)驗(yàn)試劑配制； (3) 細(xì)菌的復(fù)蘇與預(yù)培養(yǎng)、染毒劑量設(shè)定、染毒后細(xì)菌培養(yǎng)以及最后結(jié)果測(cè)定； (4) 通過(guò)樣品在600nm和420nm下的吸光光度值計(jì)算得到0-半乳糖酶活性（U)、誘導(dǎo) 率（R)，進(jìn)而判斷其是否具有遺傳毒性。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟（1)具體為： (1)活化濾膜：使用活化后的〇. 45 ym的玻璃纖維濾膜過(guò)濾水樣，去除水樣中粒徑較 大的雜質(zhì)；活化方法為：使用馬弗爐將〇. 45 ym的玻璃纖維濾膜（GF/A，70mm，Whatman)于 450°C _500°C溫度下活化3h，活化后放在干燥器中室溫平衡24h以上，使用前Ih用超純水 再活化； ⑵HLB固相萃取柱活化：使用HLB固相萃取柱（Waters Oasis，6mL)富集水體中的有 機(jī)物等，用于遺傳毒性檢測(cè)；每根HLB固相萃取柱先用6mL二氯甲烷浸泡5min，然后使溶液 緩慢流出，待液面與上層濾板平行后，關(guān)上閘門(mén)，加入6mL甲醇，使二氯甲烷溶液完全流出 后再關(guān)上閘門(mén)，之后加入6mL超純水使之緩慢流出，最后柱內(nèi)留有少量超純水； (3) 過(guò)濾：待泥沙沉淀之后，再進(jìn)行過(guò)濾；將0. 45 ym的玻璃纖維濾膜放于砂芯過(guò)濾裝 置對(duì)應(yīng)位置，砂芯過(guò)濾裝置連接真空泵（1500MA)進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的水樣用潤(rùn)洗干凈的棕 色玻璃瓶保存； (4) 水樣過(guò)柱：將HLB固相萃取柱安置在固相萃取儀頂端接口處，固相萃取柱頂端與大 流量采樣器相連，將采樣器的采樣頭放置于裝有過(guò)濾后的水樣的玻璃瓶中；將固相萃取儀 與抽濾瓶和真空泵連接，打開(kāi)真空泵并小心開(kāi)啟固相萃取儀的閥門(mén)，調(diào)節(jié)每根柱子的流量， 流速控制在6~8mL/min，每根HLB柱富集2L水樣。富集完成后用真空泵抽干部分柱內(nèi)水 分，用氮吹儀將柱子吹干，若不立即使用可在_20°C保存； (5) 樣品洗脫：在通風(fēng)櫥內(nèi)，用IOmL丙酮對(duì)HLB柱進(jìn)行洗脫，使丙酮在無(wú)外力情況下自 然流下，洗脫液用50mL棕色玻璃瓶收集，殘留的丙酮用洗耳球吹下；丙酮可以稍微過(guò)量一 些，保證樣品洗脫液達(dá)到IOmL ; (6) 合并相同樣品：將相同樣品的洗脫液進(jìn)行合并，首先對(duì)丙酮洗脫液進(jìn)行氮吹濃縮， 剩余約200 y L后合并相同水樣至同一樣品管，將其它各管用少量丙酮沖洗3-4次，同樣合 并到同一樣品管中，用氮吹儀吹至完全干燥； (7) 按照IL水樣定容至10 y L濃縮液的比例用DMSO定容樣品，-20°C保存。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟（2)具體為： (1) TGA增菌液：IOg胰蛋白胨、5g氯化鈉，11. 9g羥乙基哌嗪硫磺酸，溶于980mL蒸餾水 中調(diào)pH為7. 0±0. 2,溶解2g葡萄糖到20mL蒸餾水中，分別高壓滅菌后，將滅菌后的溶液混 合，并在無(wú)菌條件下加入50mg氨芐青霉素，此溶液在-20°C保存4周； (2) 10XTGA :不加S9實(shí)驗(yàn)：溶解胰蛋白胨10g，NaCl 5g，HEPES 11. 9g于80mL蒸餾水 中，調(diào)節(jié)PH為7.0±0. 2 ;溶解葡萄糖2g于20mL蒸餾水中，分別以121°C高壓20分鐘滅菌； 將滅菌后溶液混合，在無(wú)菌條件下加入50mg氨卞青霉素； 加 S9 實(shí)驗(yàn)：溶解胰蛋白胨 10g，NaCl 5g，KCl 2.46g，MgCl2.6H20 1.63g，HEPES 11.9g 于80mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)PH為7. 0±0. 2 ;溶解葡萄糖2g于20mL蒸餾水中，分別以121°C高 壓20分鐘滅菌；將滅菌后溶液混合，在無(wú)菌條件下加入50mg氨卞青霉素； (3) 磷酸鹽緩沖溶液：1. 〇86g Na2HPO4 ? 2H20 和 0? 538g NaH2PO4 ? H2O 溶于 IOOmL 水中， 調(diào)pH為7. 0 土0? 2,尚壓滅囷； (4) B-buffer 溶液：Na2HPO4 ? 2H20 2. 018g，NaH2PO4 ? H2O 0? 55g，KCl 0? 075g，MgSOJH2O 0. 025g，用IOOmL蒸餾水溶解，調(diào)pH為7. 0±0. 2,高壓滅菌后加入0.1 g SDS，使用前加入 270 y L的0 -巰基乙醇，在2-5°C冰箱中保存?zhèn)溆茫? (5) 輔助因子：臨用時(shí)溶解6-磷酸葡萄糖（G-6-P) 76mg、輔酶（NADP) 148mg于5mL 10XTGA中，實(shí)驗(yàn)操作需在冰上進(jìn)行； (6) 4-硝基喹啉-1-氧化物（4-NQ0)用作不加S9陽(yáng)性對(duì)照：溶解4-NQO 5mg于5mL DMSO中，-20°C保存；臨用前用含30% DMSO的溶液稀釋2000倍； (7) 2-氨基蒽（244)用作加59時(shí)的陽(yáng)性對(duì)照：溶解244 51^于51^01^0，-201：保存 (避光）；臨用前用含30% DMSO的溶液稀釋500倍； (8) 二甲基亞砜（DMSO)為稀釋溶液和溶劑對(duì)照，配制成30%的水溶液； (9) 顯色劑鄰硝基苯半乳糖苷（ONPG)為酶反應(yīng)底物：溶解ONPG 45mg于IOmL磷酸鹽 緩沖液中（臨用前2h配置，避光）； (10) 碳酸鈉為酶反應(yīng)阻斷液：Na2CO3IO. 6g溶于IOOmL蒸餾水中，配制成lmol/L的溶 液，使用前20min配制以避免出現(xiàn)沉淀。
5. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟（3)具體為： (1) 細(xì)菌復(fù)蘇： 接種鼠傷寒沙門(mén)氏菌TA 1535/pSK1002菌株：從-80°C冰箱中取出菌株，緩慢解凍后混 勻吸取1〇〇4 1原菌液加入到1〇1^164培養(yǎng)基中，15〇-18〇1'/1^11，37°〇±1°〇，振蕩孵育過(guò) 夜。第二天用TGA培養(yǎng)液10倍稀釋?zhuān)?7°C振蕩孵育I. 5-3h ; (2) 細(xì)菌預(yù)培養(yǎng)： 實(shí)驗(yàn)前一天晚上按照復(fù)蘇過(guò)程接種菌株，第二天用TGA培養(yǎng)液10倍稀釋?zhuān)?7°C振蕩孵 育I. 5-3h，以TGA培養(yǎng)基為空白對(duì)照，測(cè)定600nm(紫外光）處的細(xì)菌溶液吸光度在340到 350FNU之間，即測(cè)量值為0. 25-0. 3 ; (3) 染毒 按照下面96孔微孔板示意圖所示對(duì)待測(cè)水樣的遺傳毒性進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品最高 濃度為加入IOuL(S)水樣濃縮液，按照等體積稀釋的方法，依次設(shè)置濃度梯度：S、1/2S、 1/4S、1/8S、1/16S、1/32S。同時(shí)用去離子水作為空白對(duì)照，30% DMSO水溶液作為陰性對(duì)照， 0. 5 y g/mL 4-NQ0作為陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
6. 如權(quán)利要求2所述的方法，其中步驟（4)具體為： 0 _半乳糖酶（U)活性計(jì)算公式： 0 -半乳糖酶活性⑶=(A420樣品-A420空白V(A600樣品-A600空白） 生長(zhǎng)因子（G)活性計(jì)算公式： 生長(zhǎng)因子（G) = (A600樣品-A600空白V(A600DMS〇-A600空白） 誘導(dǎo)率（R)計(jì)算公式： 誘導(dǎo)率（R) = (A420樣品-A420空白 V(A420DMS〇-A420空白）/G 結(jié)果還可以以陽(yáng)性對(duì)照物4-NQ0的當(dāng)量濃度來(lái)表示： 以不同濃度的受試樣品或不同濃度的4-NQ0為橫坐標(biāo)，以Us值為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲 線(xiàn)，該曲線(xiàn)的斜率即為IR#Ia(unit/L)或IR4_NQ()(unit/lig)，可以計(jì)算得到樣品的4-NQ0等 當(dāng)量濃度 TEQ4_NQQ(ug/L)。 TEQ4-Nq0 - IR s/IR4-nq〇 淺層地下水的致癌風(fēng)險(xiǎn)計(jì)算方法： 按照成年人體重65kg，每日飲水量I. 6L，則樣品基于SOS/umu實(shí)驗(yàn)遺傳毒性效應(yīng)的致 癌風(fēng)險(xiǎn)為： P = [(TEQ4_nqoXO. OOlXL 5)/65] X0. 369 其中，S :樣品結(jié)果；B :空白對(duì)照結(jié)果；N :陰性對(duì)照結(jié)果； A420 :菌液在420nm波長(zhǎng)下的吸光度（顯色劑ONPG的顯色強(qiáng)度） A600 :菌液在600nm波長(zhǎng)下的吸光度（菌液濁度） 注：G > 0. 5的數(shù)據(jù)可用；R彡2可判斷陽(yáng)性。
7.如權(quán)利要求1-6之一所述的方法在檢測(cè)環(huán)境水體樣品致基因突變毒性中的應(yīng)用。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種環(huán)境水體致基因突變的遺傳毒性檢測(cè)技術(shù)及應(yīng)用，屬于環(huán)境科學(xué)和健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)領(lǐng)域。本發(fā)明以致基因突變能力為檢測(cè)終點(diǎn)，以96孔微孔板作為SOS/umu實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)載體，包括環(huán)境水體的前處理過(guò)程、細(xì)菌染毒過(guò)程、結(jié)果檢測(cè)和數(shù)據(jù)分析方法。本發(fā)明所用實(shí)驗(yàn)方法簡(jiǎn)化了現(xiàn)有SOS/umu實(shí)驗(yàn)的操作流程，提高了實(shí)驗(yàn)通量和實(shí)驗(yàn)效率，為完善水體遺傳毒性監(jiān)測(cè)技術(shù)體系提供了支持。
【IPC分類(lèi)】C12Q1-02
【公開(kāi)號(hào)】CN104846052
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510242538
【發(fā)明人】王先良, 錢(qián)巖, 郭辰, 呂占祿, 梁豹, 吳家兵, 張金良
【申請(qǐng)人】中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院
【公開(kāi)日】2015年8月19日
【申請(qǐng)日】2015年5月13日