卵巢癌的預(yù)后及分層方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本公開涉及一種用于卵巢癌預(yù)后的方法和系統(tǒng)，還涉及一種用于在預(yù)后方法和預(yù) 后試劑盒中所使用的用于識別候選基因的系統(tǒng)和方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 卵巢癌是異質(zhì)性很高的疾病，其缺少可靠的診斷、預(yù)后和預(yù)測性臨床生物標(biāo)記物。 傳統(tǒng)的臨床生物標(biāo)記物（分期、分級、腫塊等）和分子生物標(biāo)記物（CA125、KRAS、p53等）都 不適用于個體患者的早期診斷、特異性診斷、預(yù)后和疾病結(jié)果的預(yù)測。人類卵巢癌的最常見 類型是人類上皮性卵巢癌（E0C)。這一卵巢癌的特征是：在所有癌癥中，其生存率為最低之 〇
[0003] 在過去30年里，盡管為上皮性卵巢癌（E0C)疾病付出了相當(dāng)多的努力，但卵巢癌 的死亡率一直居高不下（西格爾（siegel)等，2012)。這是因為E0C患者通常在5年生存 率只有30%的晚期才被診斷出（丘（cho)等，2009 ;卡斯特（karst)等，2011 ;金姆（Kim) 等，2012)。高級別上皮性卵巢癌（HG-E0C)不管其組織學(xué)亞型和分子亞型是怎樣的，都作為 一個單獨的整體被處理。然而，HG-E0C經(jīng)常存在非常高的腫瘤異質(zhì)性、基因組不穩(wěn)定性和 改變的基因表達（萊瓦諾（Levanon)等，2008 ;施（Shi)等，2011)，而這些均使得HG-E0C正 確亞型的識別和標(biāo)記的發(fā)現(xiàn)成為一項必要的任務(wù)，以促進開發(fā)更有效的治療方法。
[0004] 卵巢癌0C標(biāo)記發(fā)現(xiàn)的前期研宄集中在0C癌樣本或細(xì)胞系的基因表達譜相對于正 常卵巢組織樣本的差異（納姆（Nam)等，2008 ;達西亞（Dahiya)等，2008 ;張（Zhang)等， 2008;王（Wang)等，2012)上。由于在0C病因和分子分型的范式轉(zhuǎn)變的基礎(chǔ)上，不能夠容 易地解釋基于細(xì)胞系的研宄，因此，一些細(xì)胞系可能不代表實際的病理-生物復(fù)雜性和腫 瘤的克隆進化（沃恩（Vaughan)等，2011)。最近的研宄表明大多數(shù)的HG-E0C起源于輸卵 管傘，或來源于乳房、結(jié)腸或其他組織的癌癥的轉(zhuǎn)移（圖馬（Tuma)，2010)。因此，具有相似 組織學(xué)亞型的兩個HG-E0C組織樣本可能在細(xì)胞環(huán)境中表現(xiàn)出不同的生物學(xué)和臨床異質(zhì)性 (丘等，2009 ;施等，2011 ;癌癥基因組圖譜（TheCancerGenomeAtlas，TCGA)，2011 ;王等， 2005;赫爾曼（Helland)等，2011 ;卡琳（Calin)等，2006;陳等，2012)，這意味著更復(fù)雜的 HG-S0C病理學(xué)并且使表征這種疾病的標(biāo)記的研宄變得復(fù)雜。
[0005] 微RNA(miRNA)是由發(fā)夾型核苷酸前體（即pre-miRNA)處理而來的小調(diào)控RNA分 子，能夠調(diào)控mRNA的翻譯和/或轉(zhuǎn)錄，其中，發(fā)夾型核苷酸前體能夠并入到RNA誘導(dǎo)的沉默 復(fù)合體中（RISC)中（拉各斯-昆塔納（Lagos-Quintana)等，2001)。由于miRNA是高度保 守的跨物種，因此，多數(shù)miRNA在重要的細(xì)胞過程中起到?jīng)Q定性作用。人類miRNA能夠調(diào)控 癌基因和腫瘤抑制基因，還能夠調(diào)節(jié)各種不同的細(xì)胞過程，例如生長、代謝、細(xì)胞分裂、分化 和凋亡（卡琳等2006 ;陳等，2012 ;瓦蘭斯坦（Valastyan)等，2011)。特定miRNA的致癌性 質(zhì)和腫瘤抑制性質(zhì)是復(fù)雜的且經(jīng)常是不明確的。例如，之前在多種癌細(xì)胞中被識別為腫瘤 抑制基因的miR-138能夠在惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤中作用為促生存的致癌miR(oncomiR)。此外， 研宄表明，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中mir-138的過度表達在具有自我更新潛能的腫瘤干細(xì)胞中起到 至關(guān)重要的作用，并且mir-138能在臨床上作為重要的預(yù)期的預(yù)后生物標(biāo)記物和化療的靶 基因（陳等，2012)。因此，miRNA的作用通常取決于細(xì)胞型和上下環(huán)境。
[0006] 仍舊有必要確定用于E0C預(yù)后的生物標(biāo)記物，并有必要找到用于E0C預(yù)后的改進 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明概括地提出了為患有上皮性卵巢癌的患者提供預(yù)后總生存或預(yù)測治療結(jié) 果（例如化療結(jié)果）的方法、系統(tǒng)和試劑盒，其中，let_7b的表達和/或與let_7b有關(guān)的 miRNA的表達和/或與let-7b有關(guān)的基因的表達被用于提供預(yù)后和/或治療結(jié)果預(yù)測。另 一方面，本發(fā)明提出了用于在預(yù)后和/或治療結(jié)果預(yù)測中識別miRNA和/或基因標(biāo)記的方 法和系統(tǒng)。
[0008] 實施例涉及一種分析方法，用于確定生物學(xué)上有意義的且生存顯著的微RNA生物 標(biāo)記物、以及它們的致癌作用、以及它們直接和間接的基因交互子。所述方法可以包括用生 物學(xué)知識整合轉(zhuǎn)錄組學(xué)信息和臨床信息以協(xié)助選擇在臨床上最相關(guān)的生物標(biāo)記物。
[0009] 在某些實施例中，整合的基因組學(xué)和生存分析用于識別腫瘤轉(zhuǎn)錄組變型和HG-E0C 的臨床異質(zhì)性之間的關(guān)聯(lián)性。一維數(shù)據(jù)驅(qū)動分組Oata-Drivengrouping，DDg)生存預(yù) 測分析（摩塔克斯（Motakis)等，2009)和聚類分析可以用于評估各個let-7成員的預(yù)后 能力以及它們的基因網(wǎng)絡(luò)交互作用。在某些實施例中，基于轉(zhuǎn)錄共表達模式分析、miRNA 的生物學(xué)通路和網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)由隨后應(yīng)用的DDg和統(tǒng)計加權(quán)投票分組（SWVg)法結(jié)合臨床學(xué)信 息可以對E0C患者進行分層，DDg和SWVg法在這里被調(diào)整為使用一種測量方式來評估患 者群體的分層件能的多奪量牛存預(yù)測分析，所述測量方式能夠?qū)蓚€以上卡普蘭-邁耶 (Kaplan-Meier，K_M)曲線的可相互比較的p值最小化。在DDg和SWVg分析后，可以用生物 學(xué)通路和網(wǎng)絡(luò)富集分析、以及臨床標(biāo)記物與從SWVg分析中形成的分層亞組之間的分類一 致性分析（阿格雷斯蒂（Agresti)，2007)來選擇用于預(yù)后或治療結(jié)果預(yù)測的、在病理-生 物學(xué)上最合理的、且有臨床意義的生物標(biāo)記物。
[0010] 在某些實施例中，還提供了一種高級別上皮性卵巢癌（HG-E0C)的預(yù)后和治療結(jié) 果預(yù)測的方法，所述方法基于患者腫瘤樣本中微RNAlet-7b和/或與let-7b有關(guān)的一系 列21個miRNA和/或與let-7b有關(guān)的一系列36個mRNA的測量結(jié)果。實施例可能涉及識 別基因或識別微RNA標(biāo)記、以及識別所產(chǎn)生的標(biāo)記本身的方法。
[0011] 實施例涉及出于將卵巢癌患者進行分層和對疾病生存能力進行預(yù)后的目的，使用 let_7b和/或與let_7b有關(guān)的非編碼和蛋白質(zhì)編碼的實體的預(yù)后方法和計算方法。所述 方法可以包括關(guān)于高級別卵巢癌患者的疾病預(yù)后對這些患者進行分層。有利地，所述方法 可以執(zhí)行為無人監(jiān)管式患者分層方法，該方法使用生存模型（Cox比例風(fēng)險回歸模型）能夠 識別新復(fù)合體生物標(biāo)記物，其中，所述生存模型包括選擇統(tǒng)計學(xué)上最顯著表達的基因的表 達譜數(shù)據(jù)，所述新復(fù)合體標(biāo)記物形成與let-7bmiRNA表達有關(guān)的基因的統(tǒng)計加權(quán)組合。所 述方法不僅選擇了生存顯著的特征，還提供了關(guān)于死亡風(fēng)險或（化學(xué)）治療阻力對患者進 行以統(tǒng)計學(xué)為基礎(chǔ)的優(yōu)化分層。
[0012] 本發(fā)明實施例的36-蛋白質(zhì)編碼-基因和21-非編碼-miRNA的預(yù)后標(biāo)記是基于 樣本中與let-7b表達模式相關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因和非編碼miRNA在患者樣本中的表達模 式的。
[0013] 特殊的實施例是針對：
[0014] (i)let-7b以及由與let-7b表達模式有關(guān)的蛋白質(zhì)編碼基因編碼的36個mRNA 的HG-E0C預(yù)后能力；
[0015] (ii)let-7b、以及與let-7b表達模式有關(guān)的21個編碼/非編碼基因及其關(guān)聯(lián)物 的HG-E0C預(yù)后能力；
[0016] (iii)將let-7b作為一個單獨的HG-E0C生物標(biāo)記物或集合的（即與諸如 21-miRNA預(yù)后標(biāo)記或36-mRNA預(yù)后標(biāo)記的其他生物標(biāo)記物一起）HG-E0C生物標(biāo)記物；
[0017] (iv)對患者的分層方法。
【附圖說明】
[0018] 圖1示出了卵巢癌中l(wèi)et_7b家族成員的分析，并包括下列：
[0019] (A)let-7b家族的成熟miRNA序列的多序列比對。
[0020](B)對于TCGA數(shù)據(jù)集（上方）和GSE27290數(shù)據(jù)集（下方），基于k均值聚類，let-7 家族成員的表達的熱點圖?；疑韑e-7家族成員的表達水平。深灰和淺灰分別代表上 調(diào)的和下調(diào)的miRNA。
[0021] (C)TCGA數(shù)據(jù)集（上方）和GSE27290數(shù)據(jù)集（下方）中基于總生存（0S)的三個 亞組的患者基于SWVg分析的卡普蘭-邁耶（K-M)生存曲線。在總生存分析中，通過將K-M 曲線的可相互比較的P值最小化來評估分層性能。列出了三個曲線的對數(shù)秩（log-rank)p 值。
[0022] (D)患者的兩個亞組的K-M生存曲線，所述兩個亞組具有不同的死亡預(yù)后（和風(fēng) 險），這兩個亞組基于0S，在TCGA數(shù)據(jù)集中是由可能的腫瘤抑制基因let-7a(上方）和可 能的致癌基因let-7b(下方）的表達譜的DDg分析進行劃分的。列出了兩個曲線的對數(shù)秩 P值；在上圖中，曲線170代表具有l(wèi)et_7a高表達的亞組，曲線175代表具有l(wèi)et_7a低表 達的亞組。在下圖中，曲線180代表具有l(wèi)et-7b低表達的亞組，曲線185代表具有l(wèi)et-7b 高表達的亞組。
[0023] 圖2示出了將患者群體分層為3個亞組的1維數(shù)據(jù)驅(qū)動分組（lDDg)法的一個實 施例的結(jié)果。左側(cè)附圖表明患者群體可以表示為通過與最小化的對數(shù)秩P值有關(guān)的兩個表 達截斷值(^和c2分層而成的三個亞組。具有不同死亡風(fēng)險的三組患者的相應(yīng)卡普蘭-邁 耶生存曲線使用交叉驗證、使用36-mRNA標(biāo)記的一個基因PIK3R1作為一個例子示出于右側(cè) 附圖中。在左圖中，位于截斷值Cl左側(cè)的曲線205代表第一個具有生存曲線220(右圖）的 低風(fēng)險亞組。相似地，位于截斷值cdPc2之間的曲線210代表具有生存曲線225的中風(fēng)險 組，以及位于截斷值c2右側(cè)的曲線215代表具有生存曲線230的高風(fēng)險組。
[0024] 圖3示出了通過實施例的36-基因標(biāo)記的交叉驗證分析所分層的患者亞組的卡普 蘭-邁耶總生存曲線（305 :低風(fēng)險；310 :中風(fēng)險；315 :高風(fēng)險）。交叉驗證過程的結(jié)果示出 了與1維DDg-SWVg分析結(jié)果具有很強的一致性，這提供了很強的指示表明1維DDg和SWVg 的參數(shù)是穩(wěn)定的。
[0025] 圖4為本發(fā)明實施例中所用數(shù)據(jù)集的匯總。
[0026] 圖5示出了由各個let-7成員的表達譜的DDg分析所分離的TCGA數(shù)據(jù)集中患者的 兩個亞組的卡普蘭-邁耶生存曲線。在圖5A-5G中，上方生存曲線代表患者具有l(wèi)et-7成員 的高表達（即，高于表達截斷值），而下方生存曲線代表患者具有l(wèi)et-7成員的低表達（即， 低于截斷值）。在圖5H和51中，上方生存曲線代表患者具有l(wèi)et-7成員的低表達（即，低 于表達截斷值），而下方生存曲線代表患者具有l(wèi)et-7成員的高表達（即，高于截斷值）。
[0027] 圖 6 不出 了使用MIRUMIR(http://www.bioprofiling.de/GEO/MIRUMIR/mirumir. html)所生成的生存曲線去評估卵巢癌（GSE27290)、乳腺癌（GSE22216)和前列腺癌 (GSE21036)中臨床結(jié)果的let-7b與let-7c的表達水平之間的關(guān)系。'低表達'亞組（L)和 '高表達'亞組（H)分別是那些miRNA的表達等級（rank)小于或大于整個數(shù)據(jù)集的平均表 達等級的亞組。
[0028] 圖7示出了由（A)整個數(shù)據(jù)集、（B)低風(fēng)險亞組、（C)中風(fēng)險亞組和（D)高風(fēng)險亞組 生成的施氏數(shù)據(jù)集（Shih's)