高效分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞a135株的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種高效分泌抗犬細(xì)小病毒(CPV)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]犬細(xì)小病毒病(Canineparvovirus disease，CPVD)是一種由犬細(xì)小病毒(Canineparvovirus, CPV)引起的以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬病毒性傳染病，該病傳染性強(qiáng)，死亡率高，各種年齡犬均可感染，幼犬的死亡率高達(dá)70%，由該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大。盡管對易感犬廣泛采取了 CPVD疫苗接種，但由于CPV對外界的抵抗力強(qiáng)、易變異，目前仍是危害我國養(yǎng)犬業(yè)最為嚴(yán)重的傳染病之一。
[0003]CPV (又稱CPV-2)是1977年由美國學(xué)者從患出血性腸炎的犬腹瀉糞便中分離得到的一種新型細(xì)小病毒，為了與1967年Binn從健康犬分離的非致病性犬極小病毒(minutevirus of canine, MVC，又稱CPV-1)相區(qū)別而被命名為CPV-2。CPV-2與MCV在致病性上顯著不同，抗原性上也有明顯差異。目前公認(rèn)CPV只有I個抗原型，即CPV-2，但CPV-2在其出現(xiàn)后的幾年時間內(nèi)已發(fā)生了抗原漂移，在抗原性、宿主范圍和血凝性上都發(fā)生了變化，其變異速度之快，在DNA病毒中是很少見的?，F(xiàn)在CPV已出現(xiàn)了多個亞型，即CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c (a)和CPV-2c (b)，對動物的感染宿主譜(如:狐、貉等)也在擴(kuò)大，嚴(yán)重威脅著家養(yǎng)和野生犬科及貓科動物的生存。
[0004]由于CPV的變異速度快，現(xiàn)有CPV疫苗的免疫效果有所下降。對臨床發(fā)病犬追溯調(diào)查發(fā)現(xiàn)，免疫犬感染不同抗原型病毒的病例屢見不鮮，CPV-2免疫犬對同型病毒(CPV-2)中和抗體(SNAb)水平明顯高于異型，較多研宄者認(rèn)為低水平的SNAb可能無法提供免疫犬對異型病毒的完全保護(hù)。此外，免疫犬感染發(fā)病的其他原因也不容忽視:①疫苗首次接種時幼犬體內(nèi)殘余的母源抗體限制了疫苗弱毒在其體內(nèi)的復(fù)制。②疫苗接種后犬在“感染窗口期”內(nèi)(約1-2周免疫產(chǎn)生期)遭受強(qiáng)毒的侵襲而感染。③某些品種、日齡的犬對強(qiáng)毒易感程度更高。
[0005]犬細(xì)小病毒病(CPVD)是一種由犬細(xì)小病毒(CPV)引起的以出血性腸炎或非化膿性心肌炎為主要特征的犬病毒性傳染病，由該病導(dǎo)致的經(jīng)濟(jì)損失巨大。用抗CPV免疫血清或抗CPV單克隆抗體對患病犬進(jìn)行治療，可降低死亡率，減少經(jīng)濟(jì)損失。預(yù)防CPVD的主要手段是接種疫苗，對患病犬的治療方法為給發(fā)病早期犬注射抗CPV血清或抗CPV單克隆抗體，同時輔助輸液、輸血、靜脈注射犬免疫球蛋白或血白蛋白等，可以有效降低病死率。目前，市場上用本動物或異源動物制備的抗CPV免疫血清，質(zhì)量不穩(wěn)定、質(zhì)控難、生產(chǎn)成本高，而且存在著外源病毒傳入、感染患病犬的巨大風(fēng)險，產(chǎn)生嚴(yán)重的生物安全問題；應(yīng)用單克隆抗體治療，可以降低上述風(fēng)險，提高療效，但現(xiàn)有的抗CPV單克隆抗體不僅中和效價(抗病毒活性)低，且對不同CPV亞型毒株的中和能力差異很大，對某些CPV亞型毒株沒有中和活性。因此，在CPVD臨床治療上，亟需研制具有中和活性高、并且對不同的CPV亞型毒株都具有高中和能力的單克隆抗體。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]技術(shù)問題
本發(fā)明的目的是提供一種高效分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，其分泌的單克隆抗體不僅中和活性高，而且對不同的CPV亞型病毒株都具有高中和能力。
[0007]技術(shù)方案
一種高效分泌抗CPV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞，該雜交瘤細(xì)胞A135株于2015年5月13日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國武漢武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC NO:C201556，分類命名:雜交瘤細(xì)胞。
[0008]所述一種高效分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞A135株可以在制備犬細(xì)小病毒單克隆抗體治療劑中得到應(yīng)用
用所述雜交瘤細(xì)胞A135株制備的犬細(xì)小病毒單克隆抗體，再用所述的單克隆抗體制備犬細(xì)小病毒單克隆抗體治療劑。
[0009]有益效果
本發(fā)明的特點和優(yōu)點如下:
1.本發(fā)明使用的BALB/C小鼠免疫原是用CPVD免疫發(fā)病犬體內(nèi)分離的CPV當(dāng)前流行強(qiáng)毒株(CPV-JS12株)制備。
[0010]2.本發(fā)明從建立的178株分泌抗CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞A135株，用其誘生的BALB/c小鼠腹水單克隆抗體對犬細(xì)小病毒的中和效價高達(dá)101(1，抗CPV的生物學(xué)活性十分優(yōu)良。
[0011]3.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞A135株分泌的單克隆抗體對CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c(a)、CPV-2c (b)等多個CPV亞型病毒株以及狐、貉源CPV毒株均表現(xiàn)高中和活性，抗CPV毒株范圍廣。
[0012]4.本發(fā)明的雜交瘤細(xì)胞株制備的單克隆抗體治療劑，用于CPV感染發(fā)病犬的臨床治療，治愈率達(dá)100%，安全無不良副反應(yīng)。
【具體實施方式】
[0013](一)單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株的建立
1.CPV抗原的制備將從CPVD免疫發(fā)病犬體內(nèi)分離的犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株CPV-JS12毒株(李月華，等.犬細(xì)小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大腸桿菌中的表達(dá).中國獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(10): 991-998)接種于FK81細(xì)胞(購自南京天邦生物科技有限公司)，將病變的細(xì)胞培養(yǎng)物凍融3次，離心去除細(xì)胞碎片，取上清液，采用PEG沉淀和不連續(xù)蔗糖密度梯度方法進(jìn)行純化，紫外分光光度計測定病毒濃度，制成CPV免疫抗原，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0014]動物免疫用純化的CPV免疫抗原經(jīng)腹腔注射免疫6?8周齡雌性BALB/c小鼠(購自揚州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實驗中心)，50 μ g/只。首免用等體積弗氏完全佐劑(Sigma公司產(chǎn)品)乳化抗原，以后每隔14d用弗氏不完全佐劑(Sigma公司廣品)乳化抗原，再免疫2次。3免后第7d斷尾采血，用間接ELISA方法測定血清抗體效價，選取血清抗體ELISA效價> 16的小鼠，在融合前3d用不加佐劑的CPV抗原經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫。
[0015]細(xì)胞融合采用PEG細(xì)胞融合方法。取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與免疫的BALB/c小鼠脾細(xì)胞按1:5?1:10的比例，充分混勻，100rpm離心lOmin，棄上清，用手掌輕擊管底，使細(xì)胞松散均勻，置40°C水浴預(yù)熱，用ImL吸管在45s內(nèi)加完預(yù)熱至40°C的50% PEG4000(Sigma公司產(chǎn)品)lmL，邊加邊輕輕振蕩，然后在90s內(nèi)加入15mL預(yù)熱至37°C的無胎牛血清的RPM1-1640培養(yǎng)基，室溫靜置lOmin，100rpm離心lOmin，棄上清，加入含15%胎牛血清(FCS)(蘭州民海公司產(chǎn)品)和HAT (Sigma公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基重懸，分裝到已有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔板上，于5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。3d后補(bǔ)加含HAT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，5d后改用含HT (Sigma公司產(chǎn)品)和15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基，1d后換成含15% FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，當(dāng)融合的細(xì)胞生長至96孔板孔底面積的1/5時，取上清進(jìn)行抗體檢測。
[0016]雜交瘤細(xì)胞的篩選按方陣法確定純化CPV抗原的包被濃度，用包被液為0.05mo I/L pH 9.6碳酸鹽緩沖液對純化的CPV抗原進(jìn)行倍比稀釋，用稀釋至400倍的CPV抗原量包被ELISA板，100 μ L/孔，置4°C包被過夜，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；以含10%小牛血清的PBST封閉每孔，200 μ L/孔，37°C放置2h，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；將融合后12d的細(xì)胞上清、1:1600稀釋的免疫小鼠陽性血清和1:1600稀釋的小鼠陰性血清，加入相應(yīng)孔內(nèi)，100 μ L/孔，37°C作用lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入1:2000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗鼠IgG，100 μ L/孔，37°C放置lh，PBST洗滌3次，每次5min，最后一次拍干；加入TMB底物，100 μ L/孔，室溫避光顯色5?1min ;每孔加入50 μ L 2mol/L硫酸終止反應(yīng)。經(jīng)酶標(biāo)儀測定OD45tol值，以空白對照調(diào)零，P為各檢測孔的值，N為陰性參考血清的OD45tol值，當(dāng)陰性參考血清的OD 45_值5 0.1，陽性參考血清的OD45tlnm值與陰性參考血清的OD45tol值的比值會2.1，即陰、陽性對照成立的前提下，P/N ^ 2.1的檢測孔判為陽性，隔2?3d后再檢測一次，對兩次檢測結(jié)果均為陽性的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。
[0017]雜交瘤細(xì)胞的克隆化首先將陽性孔活細(xì)胞用臺盼蘭進(jìn)行染色和計數(shù)，用含15%FCS (蘭州民海公司產(chǎn)品)的RPM1-1640培養(yǎng)