基稀釋成100個(gè)細(xì)胞/15mL培養(yǎng)基，將稀釋的細(xì)胞懸液加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔0.15mL，37°C，5 % 0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4?5d后，顯微鏡下可觀(guān)察到克隆細(xì)胞的形成，記錄下只有單個(gè)克隆生長(zhǎng)孔，8?9d時(shí)取細(xì)胞上清，及時(shí)進(jìn)行ELISA檢測(cè)。選擇陽(yáng)性的單克隆細(xì)胞再進(jìn)行同樣的克隆3次以上，直至克隆后所有細(xì)胞孔上清檢測(cè)均為陽(yáng)性、且各孔檢測(cè)OD45tlnm值較接近。將克隆化的IBDV特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株擴(kuò)大培養(yǎng)，凍存。經(jīng)過(guò)20次的細(xì)胞融合、篩選、克隆、鑒定，建立了 178株穩(wěn)定分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞庫(kù)。
[0018]腹水的制備將滅菌的液體石蠟腹腔注射8~10周齡的BALB/c小鼠(購(gòu)自揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心)，0.5mL /只，7天后，將雜交瘤細(xì)胞株注射入小鼠腹腔，每只0.2mL(含2X 16?5X10 6個(gè)雜交瘤細(xì)胞)，7?10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，5000 rpm離心10 min，收集上清，即為CPV單克隆抗體，分裝后于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0019]抗病毒活性分析用分泌CPV單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液與CPV-JS12毒株進(jìn)行中和試驗(yàn)的方法分析178株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的抗病毒活性。簡(jiǎn)述之:采用固定病毒稀釋抗體的方法，將FK81細(xì)胞消化后，接種于96孔細(xì)胞板中。將各株單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液(或腹水)系列稀釋分別與等體積含200 TCID5tl的CPV JS12株懸液混合均勻，37°C作用Ih，取該病毒-抗體混懸液接種于上述96孔細(xì)胞板中，0.1ml/孔，置37°C，5%C02溫箱培養(yǎng)，觀(guān)察結(jié)果(試驗(yàn)同步設(shè)立單獨(dú)CPV及正常FK81細(xì)胞試驗(yàn)對(duì)照組)。
[0020]對(duì)具有中和活性的單克隆抗體，進(jìn)一步用CPV-2a、CPV-2b、CPV_2c (a)、CPV_2c (b)等多個(gè)CPV亞型病毒株以及狐、貉源CPV毒株(以上材料均購(gòu)自南京天邦生物科技有限公司)、CPVl54毒株(購(gòu)自荷蘭英特威國(guó)際有限公司)、CPV-SP99毒株(購(gòu)自美國(guó)富道動(dòng)物保健公司)檢驗(yàn)其中和能力，篩選分泌中和效價(jià)高、且抗CPV毒株范圍廣的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，雜交瘤細(xì)胞株A135腹水的中和效價(jià)最高，并且對(duì)不同的CPV毒株及亞型毒株的中和能力相當(dāng)，腹水的中和效價(jià)達(dá)到101° J^CPV的生物學(xué)活性十分優(yōu)良。
[0021]雜交瘤細(xì)胞株A135的生物學(xué)特性
8.1雜交瘤細(xì)胞株染色體分析用姬姆薩染色法對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行染色體計(jì)數(shù)。分別取SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)，生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期，向細(xì)胞瓶中加入秋水仙素，使其終濃度為0.1 μ g/ml，然后放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4~5h。用5mL 37°C預(yù)溫的
0.075mol/L KCI低滲液將細(xì)胞吹起混勻，置37°C溫箱作用30min，向其中加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸為3:1)1 mL，邊滴加邊混勻，100rpm離心lOmin。棄上清留細(xì)胞沉淀，用5mL固定液將細(xì)胞吹起，37°C作用30min，100rpm離心lOmin，重復(fù)上述操作一次。細(xì)胞沉淀用ImL固定液懸起混勻，用滴管吸取懸液I滴，滴在預(yù)先冰凍的載玻片上，平鋪于載玻片上，自然干燥。用新配制的吉姆薩染液染色lOmin，自來(lái)水沖洗后晾干，置于顯微鏡下進(jìn)行觀(guān)察。此雜交瘤細(xì)胞株的染色體數(shù)量為94條，而骨髓瘤細(xì)胞的染色體的數(shù)量為54~64條，小鼠脾細(xì)胞染色體數(shù)量為40條，證明所獲得的此雜交瘤細(xì)胞株是兩種細(xì)胞融合的結(jié)果。
[0022]分泌單克隆抗體的穩(wěn)定性測(cè)定將獲得的雜交瘤細(xì)胞A135株進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)傳代50次、液氮凍存與復(fù)蘇試驗(yàn)，用CPV中和試驗(yàn)連續(xù)檢測(cè)，雜交瘤細(xì)胞能夠穩(wěn)定分泌單克隆抗體。
[0023]單克隆抗體的亞類(lèi)測(cè)定用單克隆抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒(購(gòu)于Thermoscientific公司)測(cè)定雜交瘤細(xì)胞A135株分泌單克隆抗體的亞類(lèi)，結(jié)果顯示，該單克隆抗體亞類(lèi)為IgGl K。
[0024]單克隆抗體的間接免疫熒光試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將CPV-JS12毒株接種到FK81細(xì)胞，培養(yǎng)72h病變后，吸棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用無(wú)血清的培養(yǎng)液洗2次，然后向細(xì)胞培養(yǎng)孔中加入-20°C預(yù)冷的無(wú)水乙醇ImL/孔，4°C固定30 min，用PBS洗3次，拍干；加入雜交瘤細(xì)胞A135株培養(yǎng)上清液，200 μ L/孔，37°C孵育lh，PBS洗滌3次，拍干；加入200倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG抗體(購(gòu)買(mǎi)于武漢博士德生物工程有限公司)，200 μ L/孔，37°C孵育lh，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀(guān)察。在熒光顯微鏡下，單克隆抗體均能與CPV-JS12感染的FK81細(xì)胞反應(yīng)，產(chǎn)生熒光，而與正常FK81細(xì)胞無(wú)熒光，進(jìn)一步證明單克隆抗體對(duì)CPV的特異性。
[0025]二 )單克隆抗體的治療性試驗(yàn)
1.試驗(yàn)動(dòng)物6周齡非免疫健康易感比格犬(CPV抗體陰性)，購(gòu)自南京安立默科技有限公司。
[0026].攻毒用強(qiáng)毒毒株為從CPVD發(fā)病犬體內(nèi)分咼的犬細(xì)小病毒強(qiáng)毒株CPV-JS12毒株，(李月華等.犬細(xì)小病毒JS12株VP2基因的分子特征及其在大腸桿菌中的表達(dá).中國(guó)獸醫(yī)科學(xué)，2013，43(10): 991-998)。用第5代FK81細(xì)胞培養(yǎng)病毒感染實(shí)驗(yàn)犬。
[0027]單克隆抗體治療劑的制備將液體石蠟注射入8?10周齡BALB/c小鼠，7天后，將雜交瘤細(xì)胞A135株注射小鼠腹腔，每只注射2 X 16?5 X 10 6個(gè)雜交瘤細(xì)胞，7?10天后采取腹部明顯鼓起小鼠的腹水，3000g，離心10 min，收集上清。單克隆抗體腹水經(jīng)56°C、30分鐘處理，離心，收集上清液，滅活補(bǔ)體，過(guò)濾除菌，用PBS稀釋至中和抗體效價(jià)1000，即為CPV單克隆抗體治療劑，分裝，置-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0028].單克隆抗體的治療性試驗(yàn)將6只6周齡非免疫健康易感比格犬隨機(jī)分成2組，每組3只，所有試驗(yàn)犬肌肉注射感染CPV-JS12株5代細(xì)胞毒2mL。隔離飼養(yǎng)2日后，將其中I組每日肌肉注射CPV單克隆抗體治療劑，注射劑量為0.5ml/kg體重，連續(xù)注射3日；另I組同法注射生理鹽水作為試驗(yàn)對(duì)照。每日觀(guān)察臨床癥狀。治療性試驗(yàn)結(jié)果:試驗(yàn)犬在接毒后相繼出現(xiàn)體溫升高、嘔吐或血便等典型的CPVD臨床癥狀，治療組犬連續(xù)注射3日CPV單克隆抗體后，全部健活，有效率達(dá)到100% ;而生理鹽水對(duì)照組分別于接毒后第5-6日后病情惡化、死亡。采集死亡犬的糞便，用CPV夾心ELISA檢測(cè)證明為CPV感染致死。試驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明制備的CPV單克隆抗體用于CPV感染發(fā)病犬的臨床治療，療效顯著。
[0029]本發(fā)明用所述雜交瘤細(xì)胞A135株制備的CPV單克隆抗體，腹水的中和效價(jià)達(dá)到101Q，并且對(duì)CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c (a)、CPV_2c (b)等多個(gè)CPV亞型病毒株以及狐、貉源CPV毒株的中和能力相當(dāng)，抗CPV毒株范圍廣，生物學(xué)性能十分優(yōu)良。所述的單克隆抗體可在制備CPV單克隆抗體治療劑中得到應(yīng)用，應(yīng)用于CPV感染發(fā)病犬的臨床治療，療效顯著，有效率達(dá)到100%。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.高效分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞A135株，該雜交瘤細(xì)胞A135株于2015年5月13日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，地址:中國(guó)武漢武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO:C201556，分類(lèi)命名:雜交瘤細(xì)胞。
2.權(quán)利要求1所述一種高效分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞A135株的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述一種高效分泌抗犬細(xì)小病毒單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞A135株在制備犬細(xì)小病毒單克隆抗體治療劑中的應(yīng)用。
4.用權(quán)利要求1所述雜交瘤細(xì)胞A135株制備的犬細(xì)小病毒單克隆抗體。
5.用權(quán)利要求4所述的單克隆抗體制備的犬細(xì)小病毒單克隆抗體治療劑。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種高效分泌抗犬細(xì)小病毒（CPV）單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞A135株，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從建立的分泌抗CPV單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫(kù)中篩選出一株雜交瘤細(xì)胞A135株，生物學(xué)性能十分優(yōu)良，注射BALB/C小鼠腹腔誘生的腹水，對(duì)CPV的中和效價(jià)高達(dá)1010，并且對(duì)CPV-2a、CPV-2b、CPV-2c（a）、CPV-2c（b）等多個(gè)CPV亞型病毒株以及狐、貉源CPV毒株的中和能力相當(dāng)，抗CPV毒株范圍廣，用于CPV感染發(fā)病犬的臨床治療，有效率達(dá)到100%。CCTCC NO：C20155620150513
【IPC分類(lèi)】C07K16-08, A61K39-395, C12N5-20, A61P31-20
【公開(kāi)號(hào)】CN104877968
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510298024
【發(fā)明人】王永山, 夏興霞, 畢振威, 李月華, 諸玉梅, 歐陽(yáng)偉, 潘群興, 王曉麗, 董晨紅, 梅永杰, 王晶宇, 吳紅玲
【申請(qǐng)人】江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【公開(kāi)日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月3日