Lrk2基因在提高水稻抵御干旱能力中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種LRK2基因在提高水稻抵御干旱能力中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 水稻作為世界上三大糧食作物之一，近一半的世界人口以大米為主食。我國(guó)也有 近65 %的人口以稻米為主食。然而世界范圍內(nèi)的降水減少和分布不均對(duì)水稻的生產(chǎn)影響很 大。農(nóng)業(yè)用水占全國(guó)用水總量的68%，而水稻用水量又占農(nóng)業(yè)用水量的六成（農(nóng)業(yè)部2008 年公開(kāi)數(shù)據(jù)）。然而，主要由于年際間雨型變化和水稻生長(zhǎng)季節(jié)降雨量的分布不均，干旱脅 迫仍然是制約水稻生產(chǎn)的最重要的單個(gè)影響因子，在遠(yuǎn)離河流的偏遠(yuǎn)山區(qū)情況更是如此。 2030年我國(guó)人口將達(dá)到16億，為滿(mǎn)足糧食需求，農(nóng)業(yè)用水將有巨大缺口，水資源緊缺將成 為21世紀(jì)我國(guó)糧食安全的瓶頸，我國(guó)水資源條件根本無(wú)法支撐傳統(tǒng)水稻的進(jìn)一步發(fā)展。因 此，增強(qiáng)水稻耐旱性以減少供水量，是減少水稻生產(chǎn)中水資源消耗的迫切需求，對(duì)我國(guó)具有 特別重要的意義。
[0003] 然而，水稻耐旱性是一個(gè)綜合性狀，包含發(fā)育、生理、生化和分子等多個(gè)方面的適 應(yīng)性變化，比如根的生長(zhǎng)發(fā)育的變化、保衛(wèi)細(xì)胞的調(diào)控、滲透適應(yīng)、光合作用的改變、保護(hù)性 蛋白和抗氧化蛋白的合成等。這些調(diào)控途徑的復(fù)雜性導(dǎo)致人們對(duì)它們的了解很少，它們?nèi)?然是目前研宄的焦點(diǎn)。水稻耐旱性與環(huán)境存在較大的互作，再加上人們對(duì)耐旱機(jī)制了解有 限，使水稻耐旱育種進(jìn)展緩慢。不過(guò)，還是有許多基因被證實(shí)在耐旱中發(fā)揮了重要作用，并 且實(shí)驗(yàn)室測(cè)定顯示，其中一些基因的遺傳轉(zhuǎn)化可以改良水稻抗旱性，如：在擬南芥和水稻中 超表達(dá)DREB1A，可提高植物對(duì)干旱、高鹽和低溫的耐性。本項(xiàng)目的研宄成果不僅能加深對(duì)水 稻抗旱調(diào)控機(jī)理的理解，而且對(duì)作物分子育種具有重要的理論與實(shí)踐指導(dǎo)意義。
[0004] 植物富亮氨酸類(lèi)受體蛋白激酶（leucine-rich-repeat receptor kinases, LRKs) 在真核生物中廣泛存在，擬南芥和水稻中分別鑒定出這個(gè)基因亞家族的216和300多個(gè)成 員。LRK在植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗性反應(yīng)中起著廣泛的調(diào)節(jié)作用，目前克隆的一些類(lèi)受體激酶 基因主要來(lái)源于擬南芥，它們分別在分生組織形成、油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、維管束分化、器 官大小和形態(tài)控制、細(xì)胞增殖、體細(xì)胞胚胎發(fā)生、以及植物創(chuàng)傷反應(yīng)等生物過(guò)程中起重要作 用。富亮氨酸類(lèi)受體蛋白激酶由信號(hào)肽、胞外富亮氨酸受體結(jié)構(gòu)域、跨膜區(qū)和胞內(nèi)激酶域4 部分組成，這些激酶位于細(xì)胞膜上，感受干旱、低溫、高鹽以及生長(zhǎng)發(fā)育等產(chǎn)生的信號(hào)，并激 活下游信號(hào)傳遞體，引發(fā)一系列信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程。例如Hong等從擬南芥植株分離到一種類(lèi)似 受體的蛋白激酶基因 RPKI，其在植物的根、莖、葉和花中都能夠表達(dá)，并且在干旱或高鹽脅 迫下均能增強(qiáng)表達(dá)。在水稻中已經(jīng)鑒定的LRK基因?yàn)閿?shù)不多，主要有：Xa21，Xa26, OsSERKI 等，水稻中大多數(shù)類(lèi)受體激酶功能尚未驗(yàn)證。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體的新用 途。
[0006] 為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明提供具體通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] 本發(fā)明提供了 LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體在提高水稻抗旱能力的應(yīng) 用。
[0008] 所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 所述的LRK2基因的表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0010] 所述的含有LRK2基因的重組載體為將所述的LRK2基因插入表達(dá)載體中，得到的 表達(dá)載體。
[0011] 在本發(fā)明中，所述的應(yīng)用為將所述的LRK2基因?qū)肽康闹参镏校玫娇购的芰Υ?于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述的LRK2基因通過(guò)所述的含有LRK2基因的重組載體導(dǎo) 入目的植物中。
[0012] 分子克隆試劑：Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System(Promega 生物有限公司）、愛(ài)思進(jìn)PCR純化試劑盒（愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)有限公司）、上海生工膠回收試 劑盒（上海生工有限公司）、高效感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒（上海GeneRay生物有限公司）、 PrimeSTAR? HS DNA Polymerase (寶生物工程（大連）有限公司）、2 X Taq Master Mix (南 京博爾迪生物科技有限公司）、Taq DNA Polymerase (TIANGEN生物（北京）有限公司）、 Trans2K Plus DNA Marker (全式金生物技術(shù)有限公司）、各種限制性?xún)?nèi)切酶（寶生物工程 (大連）有限公司以及Promega有限公司）、T4DNA Ligase (Promega有限公司）?？俁NA 提取試劑盒 RNeasy Plant Mini Kit(QIAGEN);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒 superscript III Reverse Transcriptase, RNase-Free DNase set (QIAGEN);質(zhì)粒提取試劑盒（promega)高保真酶 primestar Taq(Takara);限制性?xún)?nèi)切酶（Takara/promega)引物合成及DNA序列測(cè)定：由英 濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司和上海杰李生物有限公司完成。
[0013] 1、在本發(fā)明中：水稻 DNA 提取，可依據(jù)51^116七&1.(1996).51^11，^.，￥11，1'· S. , Tong, ff. F. and Yu, S. Μ. (1996)Carbohydrate starvation stimulates differential expression of rice alpha-amylase genes that is modulated through complicated transcriptional and posttranscriptionalprocesses. J.Biol.Chem.271,26998 -27004。
[0014] 例如為以下：
[0015] (I)取新鮮的水稻葉子放于I. 5ml離心管中，加入200 μ I裂解液。
[0016] (2)用研磨棒將葉子盡量磨成勻漿，利于裂解。
[0017] (3)將離心管放入65°C烘箱中溫育30min，每IOmin充分混勻一次。
[0018] (4)將離心管從烘箱取出，加入65 μ I 5M的KAC溶液，上下顛倒溫和混勾，然后放 置于-20°C冰浴5min。
[0019] (5)加入300 μ 1氯仿，劇烈振蕩混勾，12000rpm，離心10min。
[0020] (6)取上清液約300 μ 1，加至新的無(wú)菌I. 5ml離心管中，再加入180 μ 1異丙醇，上 下顛倒溫和混勻，室溫下放置l〇min，12000rmp，離心5min，可見(jiàn)管底部的小塊沉淀物（含 DNA)，棄上清。
[0021] (7)加入800 μ 1 70%乙醇，充分混勾，室溫下放置IOmin。
[0022] (8) 12000rmp，離心5min，棄上清，并用槍頭吸去殘留的乙醇，將離心管放在干燥 處，待管內(nèi)完全干燥后加入150-200 μ 1的PCR H2O，溶解DNA，保存于-20°C。
[0023] 2、引物設(shè)計(jì)
[0024] 檢索NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找水稻日本晴基因組，得水稻LRK2基因序列，根據(jù)載體 PCAMBIA1300S的酶切位點(diǎn)設(shè)