計(jì)引物。引物如下：
[0025] LRK2-1300-KpnI-F ：GTCGGTACCATGCAGCCACCTCATTCTTCATGCAAC ；
[0026] LRK2-1300-SalI-R :CAGGTCGACTCAGTCGGAGCCTACACTGTCCAG。
[0027] 3、載體構(gòu)建
[0028] 方法包括PCR擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物的純化，大腸桿菌質(zhì)粒的提取，酶切，連接， 大腸桿菌的轉(zhuǎn)化，陽(yáng)性菌落PCR鑒定，質(zhì)粒酶切鑒定，測(cè)序及菌種保存等。
[0029] 利用PCR技術(shù)從總cDNA中克隆LRK2的⑶S，引物設(shè)計(jì)如上（步驟2)所示。用限 制性內(nèi)切酶KpnI和Sail分別對(duì)基因片段和表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切后的產(chǎn)物分別進(jìn)行 切膠回收（見步驟4)?；厥蘸蟮漠a(chǎn)物進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、陽(yáng)性克隆鑒定、測(cè)序及序列分析，最終 獲得表達(dá)載體：pCAMBIA1300S-2X35S: :LRK2。
[0030] 4、切膠回收
[0031] 按 Biospin Gel Extraction Kit Cat#BSC02M 1 操作步騾，進(jìn)行純化。
[0032] (1)用干凈、鋒利的手術(shù)刀，將含有目的DNA片段的瓊脂糖凝膠切下，并放入I. 5mL 離心管中。
[0033] (2)按1:3 (凝膠質(zhì)量毫克數(shù)：融膠液體積微升數(shù)）的比例加入Extraction Buffer0
[0034] (3)于恒溫水浴55°C溫浴，直至凝膠融化。
[0035] (4)將混合液全部轉(zhuǎn)移到Spin column內(nèi)，于6000rpm/min離心lmin。
[0036] (5)向 Spin column 內(nèi)，加 500 μ L Extraction Buffer,于 12000rpm/min 離心 Imin，并棄去接液管內(nèi)液體。
[0037] (6)向 Spin column 內(nèi)加 750 μ L Wash Buffer,于 12000rpm/min 離心 lmin，并棄 去接液管內(nèi)液體。
[0038] (7)再次于12000rpm/min離心lmin，然后將Spin column轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的I. 5mL離 心管中。
[0039] (8)向 Spin column 內(nèi)加 30 μ L PCR H2O 于室溫下靜置 5min。
[0040] (9)于12000rpm/min離心lmin，I. 5mL離心管內(nèi)溶液中含有目的DNA片段。
[0041] 5、連接
[0042] 一般采用4°C，過(guò)夜連接，連接反應(yīng)體系如下：
[0043] 反應(yīng)體系體積（共10 μ L)
[0044] 已酶切載體（pCAMBIA1300S-2 X 35S) 1 μ L
[0045] LRK2 基因片段 3yL
[0046] IOx Ligation Buffer IyL
[0047] T4 DNA Ligase 0· 3 μ L
[0048] dd H2O 4. 7 yL〇
[0049] 6、大腸桿菌感受態(tài)制備
[0050] (1)取菌株，在LB培養(yǎng)基上劃線，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。
[0051] (2)在LB平板上挑去單克隆菌落，接種于5mL左右的LB液體培養(yǎng)基中，37°C， 250rpm培養(yǎng)過(guò)夜。
[0052] (3)將菌液以1:50的比例接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C，250rpm培養(yǎng)1-2h， 直至菌液0D600為0. 5-0. 6之間。
[0053] (4)將菌液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，預(yù)冷30min。
[0054] (5) 4°C，4000rpm 離心 lOmin。棄上清。
[0055] (6)加入5mL SSCS溶液，懸浮細(xì)胞。
[0056] (7)分裝到I. 5mL離心管（提前遇冷）中，每管100 μ L。
[0057] (8)液氮速凍，然后轉(zhuǎn)移-80 °C保存。
[0058] 7、大腸桿菌轉(zhuǎn)化
[0059] (1)從-80 °C中取出感受態(tài)，冰上融化，將連接產(chǎn)物加入并用槍輕輕打勻，冰浴 30min〇
[0060] (2)42°C熱擊90s，馬上轉(zhuǎn)移到冰上。冰浴lOmin。
[0061] (3)加入 500 μ L LB 液體培養(yǎng)基，37°C 180rpm 培養(yǎng) lh。
[0062] (4)涂布于LB固體培養(yǎng)基上（含抗生素），超凈臺(tái)吹干。
[0063] (5)倒放于37°C生化培養(yǎng)箱，培養(yǎng)過(guò)夜。
[0064] 8、陽(yáng)性克隆鑒定及測(cè)序
[0065] (I)PCR 鑒定
[0066] 用 TIANGEN Taq DNA Polymerase 做 PCR 鑒定，10 μ L 體系（如下）。在轉(zhuǎn)化的平 板上找單菌落，做好編號(hào)，用10 μ L的槍頭輕輕的碰觸單個(gè)菌落，放PCR管中輕輕攪拌一下， 作為模板。
[0067] PCR反應(yīng)體系：
[0068] DNA 模板 Iul
[0069] 2x Taq Buffer IyL
[0070] Primer I(10umol/L)0.5 μ L
[0071] Primer 2(lOumol/L)0.5 μ L
[0072] dd H2O 補(bǔ)到 10 μ L ;
[0073] 程序：
[0074] PCR 程序：
【主權(quán)項(xiàng)】
1. LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體在提高水稻抗旱能力中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體在提高水稻抗旱能力 中的應(yīng)用，其特征在于： 所述的LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示； 所述的LRK2基因的表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示； 所述的含有LRK2基因的重組載體為將所述的LRK2基因插入表達(dá)載體中所得到的表達(dá) 載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體在提高水稻抗 旱能力中的應(yīng)用，其特征在于：所述重組載體為將所述的LRK2基因插入pCAMBIA1300S 表達(dá)載體中，以2倍的35S為啟動(dòng)子，以KpnI與Sail為酶切位點(diǎn)所得到的表達(dá)載體 PCAMBIA1300S-2X35S: :LRK2〇
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種LRK2基因或含有LRK2基因的重組載體在提高水稻抗旱能力中的應(yīng)用。LRK2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；LRK2基因的表達(dá)蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；含有LRK2基因的重組載體為將LRK2基因插入表達(dá)載體中所得到的表達(dá)載體。具體而言，所述重組載體為將LRK2基因插入pCAMBIA1300S表達(dá)載體中，以2倍的35S為啟動(dòng)子，以KpnI與SalI為酶切位點(diǎn)所得到的表達(dá)載體pCAMBIA1300S-2×35S::LRK2。
【IPC分類】C12N9-12, A01H5-00, C12N15-54, C12N15-82
【公開號(hào)】CN104878026
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510342701
【發(fā)明人】查笑君, 康君方, 高爽, 潘建偉, 李健敏, 田超, 魏宇桑
【申請(qǐng)人】浙江師范大學(xué)
【公開日】2015年9月2日
【申請(qǐng)日】2015年6月18日