一株釀酒酵母及其在發(fā)酵山楂酒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一株釀酒酵母及其在發(fā)酵山楂酒中的應(yīng)用，屬于工業(yè)微生物領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 山楂是我國特有的水果，屬于薔薇科山楂屬植物，其野生品種廣泛的分布于世界 各地，但在我國早在唐代就以作為栽培水果加以利用。山楂具有重要的藥用保健價(jià)值，自古 以來，人們將它視為消食化滯、活血化痰、健脾開胃的良藥。山楂中的維生素含量豐富，維生 素 C、維生素 E以及胡蘿卜素的含量均在水果中名列前茅。除維生素外，山楂還含有豐富的 有機(jī)酸、黃酮類物質(zhì)、單寧類物質(zhì)以及礦物質(zhì)，這些成分都對人們的身體健康有著積極的影 響，可以起到提高機(jī)體免疫力、強(qiáng)健體魄的作用。據(jù)報(bào)道，山楂富含的抗氧化劑成分可以起 到防老化、起到美容、防癌和防治動(dòng)脈硬化的功效，黃酮類物質(zhì)有利于穩(wěn)定、調(diào)節(jié)血壓、降低 膽固醇，山楂中豐富的膳食纖維和果膠成分，可以促進(jìn)腸道的螺動(dòng)和消化腺的分泌，有助于 食物的消化和廢物排泄。果膠具有降低膽固醇和血糖、預(yù)防膽結(jié)石的功效。
[0003] 目前我國市場上較多的加工產(chǎn)品有山楂片、山楂糕、蜜餞山楂脯、果丹皮、山楂醬、 山楂餅、山楂耀頭、山楂酒、山楂汁、山楂飴等，而山楂酒種類少，品質(zhì)差。其中市售的山楂酒 一般多為調(diào)制酒，其制作工藝依然停留在浸泡工藝或是模仿葡萄酒加工工藝，口感上多以 苦濕為主，很難獲得消費(fèi)者青睞，一些所謂的高黃酮山楂酒是在山楂汁中加入了部分山楂 葉黃酮而得到，均為非發(fā)酵酒。山楂飲品多釆用調(diào)配工藝，產(chǎn)品定位屬于低成本快消品范 疇，很少注重產(chǎn)品的營養(yǎng)成分保護(hù)和風(fēng)味特征?，F(xiàn)有的少數(shù)發(fā)酵山楂酒多采用山楂清汁發(fā) 酵，其營養(yǎng)物質(zhì)損失較大，口感風(fēng)味較差。
[0004] 酵母是一些單細(xì)胞真菌，并非系統(tǒng)演化分類的單元。是子囊菌、擔(dān)子菌等幾科單細(xì) 胞真菌的通稱，可用于釀造生產(chǎn)。酵母是釀造山楂酒的關(guān)鍵因素之一，是影響山楂酒口感和 風(fēng)味的重要因素，決定著果酒品質(zhì)的優(yōu)劣。我國果酒釀造中使用的酵母大部分來源于商業(yè) 活性干酵母，其品質(zhì)單一，通用適用性強(qiáng)，但對于個(gè)別特殊條件適應(yīng)力差，活性干酵母在生 產(chǎn)上多經(jīng)好氧培養(yǎng)，因此其厭氧發(fā)酵性能、低溫發(fā)酵性能，耐低PH及耐乙醇性能等較差。而 山楂酒山楂汁的酸度較高，pH較低，商業(yè)活性干酵母及部分酵母菌在此條件下難以生長，導(dǎo) 致酒精產(chǎn)量低，因此有必要對酵母菌進(jìn)行篩選，從而篩出一株低PH條件下仍可以正常生長 并高產(chǎn)酒精的酵母菌。
[0005] 山楂酒口感較酸，原因是山楂酒中含有較多有機(jī)酸，其中主要有機(jī)酸為檸檬酸，檸 檬酸是三元酸，酸性較強(qiáng)。目前傳統(tǒng)的降酸方法有化學(xué)降酸法，通過添加 CaC03、K2C03、KHC03 降低酸度；物理降酸法：殼聚糖吸附降酸法、明膠吸附降酸法等。但這兩種方法易導(dǎo)致酒體 渾濁，同時(shí)破壞酒體口感，導(dǎo)致酒的品質(zhì)降低。本發(fā)明篩選出的酵母菌通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有顯 著的降檸檬酸能力，這種降酸過程在發(fā)酵中自然發(fā)生，不添加新物質(zhì)，不會導(dǎo)致酒體渾濁、 口感降低。而且通過降低酸度改善了山楂酒的口感，提升了品質(zhì)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本
【發(fā)明內(nèi)容】
的目的是提供一株適用于發(fā)酵山楂酒的特色酵母菌株，用于釀造發(fā)酵 山楂酒。
[0007] 本發(fā)明一方面提供了一種釀酒酵母Y2 (Saccharomyces cerevisiae Y2)，該株酵 母菌具有較強(qiáng)的低PH耐受能力，使用該株釀酒酵母制得的發(fā)酵山楂酒乙醇產(chǎn)量高，副產(chǎn)物 甘油少，降低檸檬酸效果好，發(fā)酵較為完全，殘?zhí)呛康?，且酒精比產(chǎn)率高，最終制得的山 楂酒風(fēng)味良好。所述釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) Y2,于2015年3月15日保 藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015119。
[0008] 本發(fā)明還提供了應(yīng)用上述釀酒酵母釀制發(fā)酵山楂酒的方法，是以山楂果漿為底物 進(jìn)行發(fā)酵。具體包括以下步驟：
[0009] 1.按1:3~1:4的料水比將山楂打漿；
[0010] 2.加入果膠酶在50°C條件下處理3~4h，果膠酶添加量150ppm ;
[0011] 3.加入200g/L葡萄糖、0. 4g/L磷酸氫二銨、0. 2g/L亞硫酸鈉，與山楂果漿混合均 勻；
[0012] 4.接入酵母菌Y2種子培養(yǎng)液，接種量15%~20% ;
[0013] 5.置于厭氧環(huán)境下進(jìn)行發(fā)酵，
[0014] 6.發(fā)酵結(jié)束后離心灌裝滅菌。
[0015] 本發(fā)明的釀酒酵母在pH2. 7-2. 9的低pH條件下產(chǎn)酒精能力強(qiáng)，乙醇產(chǎn)量比其余實(shí) 驗(yàn)酵母所釀山楂酒多15g/L以上，同時(shí)降檸檬酸效果顯著，檸檬酸從19g/L降至3g/L，副產(chǎn) 物甘油少，發(fā)酵效果比普通商業(yè)活性干酵母好，風(fēng)味口感好。
[0016] 生物材料保藏
[0017] 釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae) Y2,于2015年3月15日保藏于中國典型 培養(yǎng)物保藏中心，保藏地址為中國武漢市武漢大學(xué)，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015119。
【附圖說明】
[0018] 圖1.二級種子生長曲線
[0019] 圖2.發(fā)酵培養(yǎng)基中酵母菌生長曲線
[0020] 圖3.乙醇產(chǎn)量趨勢圖
[0021] 圖4.甘油產(chǎn)量趨勢圖
[0022] 圖5.山楂酒檸檬酸含量變化趨勢圖
[0023] 圖6.殘?zhí)呛孔兓厔輬D
[0024] 圖7.不同酵母釀造山楂酒比產(chǎn)率
【具體實(shí)施方式】
[0025] 下述實(shí)施例中各培養(yǎng)基的配方如下：
[0026] Yro培養(yǎng)基（一級種子培養(yǎng)基）：酵母提取物20g/1000mL，蛋白胨20g/1000mL，葡 萄糖20g/1000mL，自然pH值，115°C、20min高壓滅菌。固體培養(yǎng)基中加入17g/1000mL瓊脂 粉。
[0027] 二級種子培養(yǎng)基：山楂濃縮汁調(diào)整終糖濃度50g/L，加入0. 4g/L磷酸氫二銨， 0. 2g/L亞硫酸鈉，調(diào)節(jié)pH2. 7-2. 9。
[0028] 發(fā)酵培養(yǎng)基：山楂濃縮汁調(diào)整終糖濃度200g/L，加入0. 4g/L磷酸氫二銨，0. 2g/L 亞硫酸鈉。按體積比10-20%接種二級種子培養(yǎng)液，于20-25°C下發(fā)酵6-15天。
[0029] 山楂購自山東省棗莊市山亭區(qū)水泉鎮(zhèn)，品種為五棱山楂。山楂濃縮汁的制備：按 1:4的料水比將山楂打漿，加入果膠酶在50°C條件下處理3h，果膠酶添加量150ppm。
[0030] 對山楂酒樣品進(jìn)行高效液相色譜分析：
[0031] A預(yù)處理
[0032] (1)將取樣的ImL菌液放入L 5mL離心管中離心去除菌體，離心條件12000rpm， Imin0
[0033] (2)取上清液0. 75mL移入EP管中，加入0. 75mL的10%三氯乙酸溶液，振蕩混勻， 放入4°C冰箱靜置5h。
[0034] (3)靜置完畢后進(jìn)行離心，離心條件12000rpm，20min，取上清液ImL過0. 22 μπι水 系膜移入液相進(jìn)樣瓶中備用。
[0035] B液相色譜分析
[0036] 使用Shodex SClOll折射率檢測柱（昭和電工有限公司，東京，日本）分析測定葡 萄糖、果糖、乙醇、甘油和檸檬酸。在50°C，流動(dòng)相為0.0 lmol/L的稀H2SO4溶液，在50°C條 件下以lmL/min的流速進(jìn)樣。
[0037] 實(shí)施例1酵母菌的分離純化
[0038] 1.出發(fā)菌株的選育
[0039] (1)自然發(fā)酵分離酵母菌
[0040] 無菌稱量50g成熟山楂，用無菌研缽研碎后放入500mL錐形瓶中，加入150mL無菌 水，紗布封口，置于恒溫?fù)u床進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)條件30°C、150rpm。
[0041] 每隔24h取發(fā)酵液lmL，加入9mL無菌水中進(jìn)行梯度稀釋至1(T，取50 μ 1稀釋后 菌液放入YPD固體培養(yǎng)基涂布，放入30 °C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h。
[0042] (2)純化培養(yǎng)
[0043] 對培養(yǎng)箱中已培養(yǎng)48h的酵母菌株，挑取培養(yǎng)基中長出的肉眼可見的真菌菌落， 分別移入YPD固體平板培養(yǎng)基上，30°C恒溫培養(yǎng)、純化直至得到單菌落后，轉(zhuǎn)接至斜面試管 作為出發(fā)菌株，得到65株菌。
[0044] 2.酵母菌株初篩
[0045] (1)鏡檢初篩：挑取斜面試管中的菌株接種于YH)液體培養(yǎng)基中置于恒溫?fù)u床培 養(yǎng)48h，培養(yǎng)條件30°C，150rpm。以16X40倍顯微鏡鏡檢，篩選出以多端出芽繁殖的菌株， 得到26株菌。
[0046] (2) WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基篩選：將鏡檢篩選出的菌株，接種YH)液體培養(yǎng)基活化24h 后接種到WL營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，30°C培養(yǎng)5d后觀察，篩選出菌落顏色為奶油色（乳白色），球 形突起的表面光滑、不透明、奶油狀的菌株，得到7株菌。另取2株商業(yè)活性干酵母作為實(shí) 驗(yàn)對照菌株。
[0047] 3.酵母菌保藏
[0048] 取Yro液體培養(yǎng)基中底部大量菌懸液ImL于2mL甘油保藏管中，加入ImL 30 %的 甘油，放置于-80超低溫冰箱中保藏，結(jié)果如下表1所示。
[0049] 表1
[0050]
[0051] 實(shí)施例2酵母菌二級種子生長曲線
[0052] 1.取已培養(yǎng)20h的酵母種2. 5mL于50mL二級種子培養(yǎng)基中，接種量5%，每組做 兩個(gè)平行。
[0053] 2.用紗布封口，置于恒溫?fù)u床進(jìn)