一種降香黃檀黑痣病菌分子檢測(cè)引物及快速檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病害的分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種降香黃檀黑痣病菌分子檢測(cè) 引物及其檢測(cè)方法，可用于降香黃檀黑痣病的早期診斷和病菌的監(jiān)測(cè)與鑒定。
【背景技術(shù)】
[0002] 降香黃檀是海南省熱帶珍貴鄉(xiāng)土樹(shù)種之一，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)樹(shù)種，在我們國(guó)家標(biāo) 準(zhǔn)的5屬8類(lèi)34種紅木中，是僅次于紫檀類(lèi)的紅木。其材質(zhì)硬重，強(qiáng)度大，干燥不開(kāi)裂，不 變形，結(jié)構(gòu)均勻，是制造名貴家具、工藝品、樂(lè)器、雕刻和名貴裝飾的上等用材。
[0003] 隨著海南省降香黃檀人工林種植面積不斷增加，病蟲(chóng)害問(wèn)題日益突出。降香黃檀 黑痣病是由黃檀黑痣菌引起的，是降香黃檀苗期和幼樹(shù)期的主要病害。海南省高溫高濕 的氣候特點(diǎn)，使降香黃檀全年遭受黑痣病的侵害，常年發(fā)病率達(dá)45 %~65 %，嚴(yán)重時(shí)可達(dá) 80%以上。該菌所致病害會(huì)在寄主表面形成黑色凸起的盾片，發(fā)病后期盾片覆滿整個(gè)寄主 葉片表面，嚴(yán)重影響植物的光合作用，致使其提前落葉。
[0004] 黃檀黑痣菌可侵染寄主的葉、枝、莖、莢果等地上部分，病菌主要以菌絲體在病葉 或病落葉上越冬，成為次年的初次侵染來(lái)源。春末、夏初天氣潮濕多雨，病菌開(kāi)始侵染，在適 宜的溫濕度條件下，黃檀黑痣菌產(chǎn)生的子囊孢子迅速繁殖，借助風(fēng)雨迅速傳播侵染附近的 植株，形成發(fā)病中心。發(fā)病后期，被侵染的植株，整株葉片和枝條上會(huì)覆滿大量的黑疲，剛萌 發(fā)的新葉亦受侵染發(fā)病。遇暴雨臺(tái)風(fēng)天氣，臺(tái)風(fēng)造成降香黃檀葉片、果實(shí)等損傷，病原菌即 從微傷口侵入，且臺(tái)風(fēng)期的高溫天氣加之臺(tái)風(fēng)后的暴雨，林間積水嚴(yán)重，加上便于侵入的微 傷口導(dǎo)致黑痣病的爆發(fā)。
[0005] 目前，國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)降香黃檀黑痣病菌研宄涉及的較少，在分子水平的研宄更是鮮 有報(bào)道。傳統(tǒng)植物病害診斷方法需要經(jīng)過(guò)病原菌分離、培養(yǎng)、鑒定等過(guò)程，耗時(shí)長(zhǎng)、工作量 大，可能會(huì)錯(cuò)過(guò)病害防治的最佳時(shí)期。且由于黑痣屬真菌是一類(lèi)專(zhuān)性寄生的活體營(yíng)養(yǎng)真菌， 即它不能夠在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，因而不能用組織分離法分離出病原菌，給該病害的準(zhǔn)確診斷 帶來(lái)了極大的困難。因此，建立一套結(jié)果可靠、易于操作、靈敏度高的黃檀黑痣菌分子檢測(cè) 技術(shù)，對(duì)病害發(fā)生情況進(jìn)行預(yù)報(bào)預(yù)測(cè)，對(duì)及時(shí)采取有效的防治措施控制病原菌的進(jìn)一步發(fā) 生有著非常重要的理論和實(shí)際意義。
[0006] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR)技術(shù)為代表的分子檢測(cè)方 法得到了迅速的發(fā)展和應(yīng)用。由于核糖體基因 ITS序列在真菌種間的高度變異和種內(nèi)的穩(wěn) 定性，為病原物的分子檢測(cè)提供了理想的靶序列。相較于傳統(tǒng)的病害診斷技術(shù)，巢式PCR技 術(shù)在靈敏度、檢出率及專(zhuān)一性方面均有了很大的提高，且不需要進(jìn)行病原菌的分離培養(yǎng)等 特點(diǎn)。本文依據(jù)rDNA的ITS序列在真菌種內(nèi)保守性和種間變異性的特點(diǎn)，通過(guò)設(shè)計(jì)針對(duì)黃 檀黑痣菌特異性引物，結(jié)合真菌通用引物ITS4/ITS5對(duì)降香黃檀基因組DNA進(jìn)行巢式PCR 擴(kuò)增，在降香黃檀黑痣病表現(xiàn)出明顯癥狀之前將黃檀黑痣菌快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)出來(lái)，為該病 害的早期診斷和預(yù)防提供行之有效的技術(shù)方案。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中降香黃檀黑痣病菌還沒(méi)有系統(tǒng)的分子檢測(cè)方法的現(xiàn)狀，本發(fā)明提 供了一種降香黃檀黑痣病菌分子檢測(cè)引物以及降香黃檀黑痣病菌的快速檢測(cè)方法。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：
[0009] 一種降香黃檀黑痣病菌分子檢測(cè)引物，序列如下：
[0010] 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3'
[0011] 下游引物：P2:5' -TGAAGAACGCAGCGAAAT-3'。
[0012] 一種降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測(cè)方法，包括下列步驟：
[0013] 1)提取降香黃檀葉片基因組DNA ;
[0014] 2)巢式PCR反應(yīng)：
[0015] 第一輪PCR反應(yīng)：以ITS4/ITS5為引物進(jìn)行第一輪PCR ;第二輪PCR反應(yīng)：以Pl/ P2為引物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，
[0016] 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3'
[0017] 下游引物：P2:5' -TGAAGAACGCAGCGAAAT-3' ；
[0018] 3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析
[0019] 取步驟2)擴(kuò)增產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上成像；
[0020] 4)結(jié)果判定
[0021] 根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性地?cái)U(kuò)增出273bp的產(chǎn)物，即可判斷 植物組織中存在黃檀黑痣菌。
[0022] 步驟2)巢式PCR反應(yīng)第一輪PCR反應(yīng)：
[0023] 以ITS4/ITS5為引物進(jìn)行第一輪PCR，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2XTaq PCR MasterMix 12. 5 μ L，步驟1)制備的降香黃檀葉片總DNA 1 μ L，10 μmol/L上游引物及下游引物各 1 μ L，最后用CldH2O補(bǔ)足至25 μ L，離心15sec后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為： 94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30sec，55°C退火30sec，72°C延伸lmin，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0024] 所述的引物ITS4/ITS5序列如下：
[0025] ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3' ；
[0026] ITS5 :5,-GGA AGGTAA AAG TCA AGG-3, 。
[0027] 步驟2)巢式PCR反應(yīng)第二輪PCR反應(yīng)：
[0028] 以P1/P2為引物進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，擴(kuò)增反應(yīng)體系為：2XTaq PCR MasterMix 12.5 41^、141^第一輪？〇?擴(kuò)增產(chǎn)物、1(^111〇1/1引物？1/?2各141^，最后用(1(1!120補(bǔ)足至 25 μ L，離心15sec后置于PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 IOmin0
[0029] 步驟3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分析：取步驟2)擴(kuò)增產(chǎn)物4 μ L，用I X TAE作為電泳緩沖液， 在1. 0%瓊脂糖凝膠上，5V/cm電壓采用進(jìn)行電泳檢測(cè)，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng) 上成像。
[0030] 步驟 3)所述的電泳緩沖液（50XTAE)成分為：Tris242g，Na2EDTA · 2H20 37. 2g， 加入800ml去離子水，加入57. Iml醋酸，充分?jǐn)嚢韬蠖ㄈ葜罥L ;工作濃度為I X TAE。
[0031] 本發(fā)明設(shè)計(jì)了一對(duì)黃檀黑痣菌特異性引物，并成功建立了一種降香黃檀黑痣病發(fā) 病早期的快速檢測(cè)方法。與其他檢測(cè)方法相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0032] 1.采用本發(fā)明，可以特異性檢測(cè)出黃檀黑痣菌。本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異性引物可以區(qū) 分分離自降香黃檀及大果紫檀的病原菌及內(nèi)生真菌，參見(jiàn)附圖1。
[0033] 2.采用本發(fā)明，可以檢測(cè)出IOOag/ μ L的黃檀黑痣菌DNA，相較于常規(guī)的微生物檢 測(cè)方法其靈敏度較高。
[0034] 3.采用本發(fā)明方法檢測(cè)十分快速，8個(gè)小時(shí)內(nèi)就可以檢測(cè)出降香黃檀是否已經(jīng)受 到黃檀黑痣菌的侵染，該技術(shù)的應(yīng)用對(duì)降香黃檀黑痣病的早期檢測(cè)、提早預(yù)防具有十分重 要的意義。
【附圖說(shuō)明】
[0035] 圖1是本發(fā)明所設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)黃檀黑痣菌總DNA的擴(kuò)增圖譜，
[0036] 泳道M :2000bp DNA marker，分子量標(biāo)準(zhǔn)從上到下依次為：2000bp、1000bp、750bp、 500bp、273bp、100bp(為天根生化科技公司產(chǎn)品，目錄號(hào)：MD114-02);
[0037] 泳道1-11分別為表1所述采集自9個(gè)市縣的黃檀黑痣菌：樣本BOl、B04-B09各提 供1份，B02、B03各提供2份（見(jiàn)表1)。
[0038] 圖2是本發(fā)明所設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)黃檀黑痣菌及其他真菌分離物總DNA的擴(kuò)增圖 譜，
[0039] 泳道M :2000bp DNA marker (為天根生化科技公司產(chǎn)品），產(chǎn)品描述如上；
[0040] 泳道1 :陰性對(duì)照，
[0041] 泳道2為黃檀黑痣菌，泳道3-8為禾草黑痣菌，泳道9-10為剛竹黑痣菌，泳道 11-12膠孢炭疽菌，泳道13為莖點(diǎn)霉，泳道14為B16,泳道15為尖孢鐮刀菌，泳道16為甘 藍(lán)鏈格孢菌，泳道17為博寧刺盤(pán)孢，泳道18為鐮孢菌，泳道19擬盤(pán)多毛孢，泳道20為球孢 黑抱霉。
[0042] 圖3是本發(fā)明所設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)黃檀黑痣菌總DNA檢測(cè)的靈敏度的擴(kuò)增圖譜，
[0043] 其中，圖3-A為采用常規(guī)PCR對(duì)不同濃度的黃檀黑痣菌總基因組DNA的擴(kuò)增圖譜；
[0044] 泳道M :2000bp DNA marker (為天根生化科技公司產(chǎn)品），產(chǎn)品描述如上，
[0045] 泳道1 :陰性對(duì)照，
[0046] 泳道 2-12 :分別為 IOOng/ μ L，IOng/ μ L，Ing/ μ L，IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L，Ipg/ μ L, IOOfg/ μ L, IOfg/ μ L, lfg/ μ L, IOOag/ μ L, IOag/ μ L 黃檀黑疲菌基因組 DNA ;
[0047] 圖3-Β為采用巢式PCR對(duì)不同濃度的黃檀黑痣菌總基因組DNA的擴(kuò)增圖譜，
[0048] 泳道M :2000bp DNA marker (為天根生化科技公司產(chǎn)品），產(chǎn)品描述如上，
[0049] 泳道 2-12 :分別為 IOOng/ μ L，IOng/ μ L，Ing/ μ L，IOOpg/ μ L，IOpg/ μ L，Ipg/ μ L, IOOfg/ μ L, IOfg/ μ L, lfg/ μ L, IOOag/ μ L, IOag/ μ L 黃檀黑疲菌基因組 DNA。
[0050] 圖4是本發(fā)明所設(shè)計(jì)特異性引物對(duì)采集于林間的降香黃檀樣品檢測(cè)圖譜，
[0051] 泳道M :2000bp DNA marker (為天根生化科技公司產(chǎn)品），產(chǎn)品描述如上，
[0052] 泳道1 :陰性對(duì)照，
[0053] 泳道2-12 :分別為健康（無(wú)病斑）降香黃檀葉片組織，
[0054] 泳道13-24 :分別為發(fā)病降香黃檀葉片組織。
【具體實(shí)施方式】
[0055] 實(shí)施例1 :檢測(cè)本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異引物對(duì)黃檀黑痣菌的特異性擴(kuò)增
[0056] 1.黑疲病葉樣品的制備
[0057] 參見(jiàn)表1列舉的各供試樣品及其采集地點(diǎn)。將降香黃檀、白草、狼尾草、鵝觀草、剛 竹黑痣病病葉樣本用75%酒精表面消毒后，使用滅菌剪刀將病葉剪成4X 4mm大小的組織 塊，加液氮進(jìn)行研磨。黑痣病病葉樣品編號(hào)：BOl~B13。
[0058] 表1各供試樣品采集地點(diǎn)及分子檢測(cè)結(jié)果
[0059]
[0060] " + "表示可以檢測(cè)到273bp的目的條帶，表示不能檢測(cè)到273bp的目的條帶。 [0061 ] 2.對(duì)照菌株樣品的制備
[0062] (1)將采集到的降香黃檀、大果紫檀病葉樣品（B14、B15、B18~B20)，使用滅菌的 剪刀剪取典型病斑的病健交界處，剪成4mmX4mm大小的小塊，先于75%酒精中浸8~IOs 后，再于〇. 1 %升汞溶液中消毒30s，使用滅菌蒸餾水洗滌3~4次，用滅菌的濾紙吸干組織 塊表面水分后，接種于PDA培養(yǎng)基上，25°C條件下培養(yǎng)。5d后，從組織塊邊緣挑取小塊菌落 至PDA培養(yǎng)基上，25°C條件下培養(yǎng)5d后，在體式顯微鏡下挑取單菌絲至新鮮PDA上，5d后將 菌株轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上4°C保存。保存菌株編號(hào)：B14、B15、B18~