B20,表1。
[0063] (2)內(nèi)生真菌的分離培養(yǎng)：取健康的降香黃檀、大果紫檀葉片，剪成大小為 4_X4mm的小塊后，余下步驟同1，均采用組織塊分離法進行內(nèi)生真菌的分離純化，最后將 純化后的菌株轉(zhuǎn)至斜面培養(yǎng)基上4°C保存。保存菌株編號：816、817、821322，表1。
[0064] 3.降香黃檀葉片基因組DNA的提取
[0065] 將降香黃檀葉片用75%酒精表面消毒后，使用滅菌剪刀將葉片剪成4X4mm大小 的組織塊，用液氮將其研磨至粉末狀后，移至已滅菌的2mL Eppendorf管中。在Eppendorf 管中加入 700 μ L 的 2XCTAB 抽提液（2XCTAB :20mmol/L EDTA，lOOmmol/L Tris-HCl， 1.4mol/L NaCl，PH值為8.0)，確保兩者混勻?；靹蚝螅尤?0yL蛋白酶K，在干式恒溫 金屬浴中37°C溫育30min，再放入60°C水浴鍋中，期間每隔IOmin顛倒混勻一次。Ih后， 12000g離心Smin后取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)，上下顛倒混勻后，12000g 離心15min，移取上清液至新的Eppendorf管中。再加入等體積氯仿/異戊醇，充分混勾。 同上條件再離心15min后，取上清，加入與上清液等體積的異丙醇和1/10體積的3mol/L的 NaAc(pH5. 2)，上下顛倒混勻，待出現(xiàn)沉淀后放置于-20°C低溫冰箱中過夜。過夜后取出，同 上條件離心2min，去除上清液，用70%的乙醇洗滌沉淀兩次，用小槍頭盡量去除殘留乙醇， 放至于超凈工作臺中風干。確保離心管內(nèi)無殘留乙醇后，加入30yL TE緩沖液（含RNase 50 μ g/mL)溶解沉淀，得到降香黃檀葉片總DNA，用紫外分光光度計檢測DNA濃度并稀釋至 IOOng/μ L，-20°C保存。
[0066] 4.對照菌株基因組DNA提取
[0067] 用滅菌的解剖刀刮取對照菌株（B14~B22)的菌絲體（注意不要刮到培養(yǎng)基）， 轉(zhuǎn)移至已滅菌的2mL Eppendorf管中，加入0. 2g石英砂，使用研磨器充分研磨菌絲體，余下 DNA提取步驟同3,均使用改良后的CTAB法提取。編號見表1。
[0068] 5.黃檀黑痣菌的特異檢測
[0069] PCR反應(yīng)體系 25 μ L，包括 2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ L，IOOng 模板DNA 1 μ L， ΙΟμ mol/L Ρ1/Ρ2各lyL，用CldH2O補足至25yL，離心15sec后置于PCR儀中進行擴增； PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min ;94°C變性30sec，56°C退火30sec，72°C延伸lmin，共35 個循環(huán)；72°C延伸IOmin。
[0070] 6.檢測結(jié)果
[0071] 如圖1所示。所設(shè)計的特異性引物僅能從供試的11個P. dalbergiicola的DNA 中特異地擴增出一條長約273bp的條帶，而其他18個供試DNA均無擴增條帶，表明該引物 具有很強的特異性，見圖2。
[0072] 實施例2 :引物對黃檀黑痣菌的靈敏性檢測
[0073] I. DNA濃度稀釋
[0074] 提取的黃檀黑痣菌基因組DNA，通過紫外光分光光度計測定濃度后，將黃檀黑痣菌 基因組DNA，從IOOng/μ L的濃度開始，逐步按10倍數(shù)量級向下稀釋至IOag/μ L。
[0075] 2.特異性引物的靈敏性檢測
[0076] 第一輪PCR反應(yīng)：以ITS4/ITS5為引物進行第一輪PCR，擴增反應(yīng)體系為：2XTaq ?〇?1&^七6滷丨112.5 4 1^，步驟1)制備的降香黃檀葉片總0嫩1以1^，1(^111〇1/1打54/1丁55 各1 μ L，最后用CldH2O補足至25 μ L，離心15sec后置于PCR儀中進行擴增；PCR反應(yīng)條件 為：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；72°C 延伸lOmin。
[0077] 以ITS4/ITS5為引物對黃檀黑痣菌進行PCR擴增得到的片段序列如下，方框內(nèi)的 堿基為引物。
[0078] TTCCTCCGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTACTCTTATCTGATTCGAGGTCAAGAATCAAACG TCTTGTGGTAGAAAGATTCTGCTGGAAGAGTCATATGATCGTTCTCTTCAAACAACACCTTTCTGCCAAATGGATTT GACAAGCTACGATAATCGTAGACCTGCAACACAAGCCGAGCTTGAGGGAGAGAAATGACGCTCGAACAGATATGCCT GCTAGCATGCTAGCAGGCGCAATGTGCGTTCAAAAACTCGATGTCTCACTAAGCCTTGCAATTCACATTATTTATCG CATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCTAGAGCCAAGAGATCCATTGATAAAGGTTTTCATAAGTTAACCAACATACA AATTACATTTATAGATTGTACAACCATTGGCAAGCCAGAGCTTGCCAACGCAACGAATACAGGTTCACAGTGAGGTT GAGGTAAAAACCACATGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCTTGTTACGACTTTTACTTCC
[0079] 第二輪PCR反應(yīng)：以P1/P2為引物進行第二輪PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)體系為：2 X Taq PCR MasterMix 12. 5 μ L、1 μ L 第一輪 PCR 擴增產(chǎn)物、10 μ mol/L 引物 P1/P2 各 1 μ L，最后 用CldH2O補足至25 μ L，離心15sec后置于PCR儀中進行擴增；PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸 lmin，共 35 個循環(huán)；72°C延伸 lOmin。電 泳檢測擴增產(chǎn)物。
[0080] 3.檢測結(jié)果：如圖3-A所示，在25 yL的反應(yīng)體系中，利用引物P1/P2進行常規(guī)PCR 擴增，可從含有Ipg的基因組DNA中擴增出一條長約273bp的條帶，而先后利用ITS4/ITS5 和P1/P2進行巢式PCR，可以穩(wěn)定地檢測到IOOag的基因組DNA。這與單獨使用特異性引物 擴增相比，使檢測靈敏度提高了 IO4倍。
[0081] 實施例3 :降香黃檀發(fā)病組織中的黃檀黑痣菌的檢測
[0082] 1.樣品采集
[0083] 從海南省國營澄邁林場采集降香黃檀葉片的發(fā)病組織及健康組織共23份樣品， 利用巢式PCR進行檢測。
[0084] 2. DNA提取及檢測
[0085] 采用
【發(fā)明內(nèi)容】
中步驟2所述的植物組織DNA提取方法，按上述實施的方法進行巢 式PCR擴增，PCR反應(yīng)體系25 μ L，巢式PCR反應(yīng)體系以引物ITS4/ITS5作為第一輪反應(yīng)引 物，取I μ L第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物作為模板，結(jié)合黃檀黑痣菌特異性引物進行第二輪PCR擴 增，反應(yīng)程序及檢測方法同
【發(fā)明內(nèi)容】
中所述。
[0086] 3.檢測結(jié)果
[0087] 結(jié)果見圖4,利用巢式PCR能從12個發(fā)病組織（泳道13~24)中穩(wěn)定的擴增出 一條約為273bp的特異性條帶，而11個健康植物組織（泳道2~12)中也有6個擴增出條 帶，說明該健康植物組織已受到黃檀黑痣菌的侵染，暫未表現(xiàn)出明顯的癥狀。對擴增出條帶 的泳道進行切膠回收測序，測序結(jié)果表明它們的堿基序列一致，且與黃檀黑痣菌的序列完 全相同，則可排除假陽性結(jié)果。
[0088] 本實施例總計需要時間=Ih 30min (提取DNA) +2h 30min (第一輪PCR) +2h 3Omin (第二輪 PCR) +Ih 3Omin (電泳 + 成像）=8hours。
【主權(quán)項】
1. 一種降香黃檀黑痣病菌分子檢測引物，其特征在于，序列如下： 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3'2. -種降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測方法，其特征在于，包括下列步驟： 1) 提取降香黃檀葉片基因組DNA; 2) 巢式PCR反應(yīng)： 第一輪PCR反應(yīng)：以ITS4/ITS5為引物進行第一輪PCR ;第二輪PCR反應(yīng)：以P1/P2為 引物進行第二輪PCR反應(yīng)， 上游引物：Pl: 5' -CGAGGTCAGAATCAAACG-3' 下游引物：P2:5' -TGAAGAACGCAGCGAAAT-3' ； 3. PCR擴增產(chǎn)物分析 取步驟2)擴增產(chǎn)物，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上成像； 4) 結(jié)果判定 根據(jù)擴增產(chǎn)物的大小判定結(jié)果，如果能特異性地擴增出273bp的產(chǎn)物，即可判斷植物 組織中存在黃檀黑痣菌。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測方法，其特征在于， 步驟2)巢式PCR反應(yīng)第一輪PCR反應(yīng)： 以ITS4/ITS5為引物進行第一輪PCR，擴增反應(yīng)體系為：2XTaqPCRMasterMix12. 5yL，步驟1)制備的降香黃檀葉片總DNAlyL，10ymol/L上游引物及下游引物各IyL， 最后用CldH2O補足至25 yL，離心15sec后置于PCR儀中進行擴增；PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù) 變性 4min;94°C變性 30sec，55°C退火 30sec，72°C延伸lmin，共 35 個循環(huán)；72°C延伸lOmin。4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測方法，其特征在于， 所述的引物ITS4/ITS5序列如下： ITS4 :5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'； ITS5 :5,-GGAAGGTAAAAGTCAAGG-3,。5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測方法，其特征在于， 步驟2)巢式PCR反應(yīng)第二輪PCR反應(yīng)： 以P1/P2為引物進行第二輪PCR反應(yīng)，擴增反應(yīng)體系為：2XTaqPCRMasterMix12. 5yL、lyL第一輪PCR擴增產(chǎn)物、10ymol/L引物P1/P2各IyL，最后用CldH2O補足至 25yL，離心15sec后置于PCR儀中進行擴增；PCR反應(yīng)條件為：94°C預(yù)變性4min;94°C變性 30sec，56°C退火 30sec，72°C延伸lmin，共 35 個循環(huán)；72°C延伸IOmin06. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的降香黃檀黑痣病菌的快速分子檢測方法，其特征在于， 步驟3)PCR擴增產(chǎn)物分析：取步驟2)擴增產(chǎn)物4yL，用IXTAE作為電泳緩沖液，在 1. 0%瓊脂糖凝膠上，5V/cm電壓采用進行電泳檢測，經(jīng)溴化乙錠染色后在凝膠成像系統(tǒng)上 成像。
【專利摘要】本發(fā)明屬于植物病害的分子檢測領(lǐng)域，具體涉及一種降香黃檀黑痣病菌的分子檢測引物及其檢測方法。采用設(shè)計出的一對降香黃檀黑痣病菌特異引物經(jīng)過巢式PCR擴增，PCR產(chǎn)物擴增分析，瓊脂糖凝膠電泳和結(jié)果判定。若樣本中存在黃檀黑痣菌，在紫外光下瓊脂糖凝膠中會出現(xiàn)一條273bp的目的條帶，若未出現(xiàn)條帶，則代表不存在黃檀黑痣菌。本發(fā)明的引物特異性強，可以區(qū)分黃檀黑痣菌、禾草黑痣菌、剛竹黑痣菌以及分離自降香黃檀、大果紫檀的其他病原菌及內(nèi)生真菌；該引物靈敏度高，可檢測下限至100ag/μL的黃檀黑痣菌基因組DNA；本發(fā)明快速，8小時內(nèi)即可得到準確的檢測結(jié)果，而利用傳統(tǒng)的病害診斷方法至少需要4天或1周以上。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11, C12Q1/04
【公開號】CN104911262
【申請?zhí)枴緾N201510282697
【發(fā)明人】周國英, 劉君昂, 董文統(tǒng), 何苑嗥, 劉倩麗, 劉成鋒
【申請人】中南林業(yè)科技大學(xué)
【公開日】2015年9月16日
【申請日】2015年5月28日