Endostatin突變體、Endostatin突變體與聚乙二醇的交聯(lián)物以及它們的應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種Endostatin突變體、Endostatin突變體與聚乙二醇的交聯(lián)物以 及它們的應用，具體涉及它們在眼部新生血管疾病治療中的應用。
【背景技術】
[0002] 視網膜和脈絡膜疾病是目前眼科臨床發(fā)病率越來越高且難以治療的一類疾病， 包括早產兒視網膜病變、老年性黃斑病變、高度近視黃斑病變、增生性糖尿病視網膜病變、 視網膜靜脈阻塞以及視網膜靜脈周圍炎所導致的視網膜脈絡膜的新生血管等。據文獻報 道，增生性糖尿病視網膜病變的發(fā)病率為3. 6%，70歲以上年齡組老年黃斑變性發(fā)病率可達 25%。據此預計，我國目前受到眼內新生血管性疾病困擾面臨失明危險的患者人數將超過 3000萬。中國每年新增DME(diabetic macular edema,糖尿病性黃斑水腫)超過30萬例。 糖尿病現(xiàn)在是美國境內新增失明病例的主要原因，DME困擾著美國境內至少560000例糖尿 病患者，每年新增病例達75000人次。新生血管形成是這些疾病的重要表現(xiàn)形式，有效而安 全的抗新生血管治療成為臨床眼科醫(yī)師迫切需要的治療手段。
[0003] 目前對視網膜、脈絡膜新生血管（CNV)的治療方法主要有光動力療法、經瞳孔溫 熱療法、激光光凝、放射療法等，但這些治療方法僅在新生血管局部起作用，臨床療效有限， 且治療時的局部損傷又可誘發(fā)新生血管，更不能預防新生血管再形成。
[0004] 諾華和羅氏聯(lián)合銷售的、用于治療眼底新生血管疾病的Lucentis(蘭尼單抗） 于2006年上市，2008年銷售額達到17. 68億美元，超越拉坦前列素成為全球最暢銷的眼 科用藥。2012年1月，Lucentis獲準在中國上市，用于治療老年相關性黃斑變性（AMD， age-related macular degeneration)。這種疾病會造成黃斑部（眼睛視網膜中心的一部 分）損傷，可能導致失明和嚴重的視力損失。Lucentis是一種VEGF抗體的片段，屬于外源 性血管抑制劑，常見結膜出血、眼睛疼痛等副作用，極少數的出現(xiàn)動脈血栓、腦中風、心肌梗 死及急性冠脈綜合癥等嚴重藥物不良反應事件。
[0005] 1971年，美國哈佛大學兒童醫(yī)學院的Judah Folkman教授提出腫瘤血管阻斷理 論：腫瘤的生長和遷移依賴于新生血管生成，阻斷新生血管的生成可能阻止腫瘤的生長和 轉移。1996年，Judah Folkman實驗室的O'Reilly發(fā)現(xiàn)了血管內皮抑制素（endostatin), Endostatin是在基質蛋白質中分離出來的內源性新生血管抑制因子，是膠原蛋白XVIII C 末端分子量為20kDa的片段。血管內皮抑制素可以抑制內皮細胞的遷移和增殖，進而可有 效抑制動物模型中成纖維細胞瘤（Fibrosarcoma)T241、黑色素瘤（Melanoma)B16/F10和惡 性血管內皮細胞瘤（Hemangioendothelioma) EOMA等的生長。

【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種Endostatin突變體、Endostatin突變體與聚乙二醇的 交聯(lián)物以及它們的應用。
[0007] 本發(fā)明要求保護將Endostatin自N末端第1位氨基酸殘基和第3位氨基酸殘基 突變?yōu)槠渌被釟埢玫降牡鞍踪|（Endostatin突變體);所述Endostatin是如下（a)或 (b) : (a)由序列表中序列1自N末端第2-184位氨基酸殘基組成的蛋白質；（b)將（a)經 過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與新生血管形成相關的由其衍生 的蛋白質。所述其它氨基酸殘基為含羧基的氨基酸殘基、含氨基的氨基酸殘基、含酰胺基的 氨基酸殘基或含苯環(huán)的氨基酸殘基。所述Endostatin突變體具體可為如下（c)或（d): (c) 由序列表中序列3自N末端第2-184位氨基酸殘基組成的蛋白質；（d)由序列表中序列5 自N末端第2-184位氨基酸殘基組成的蛋白質。
[0008] 本發(fā)明還保護含有所述Endostatin突變體的蛋白質，具體可為如下（e)或（f): (e)由序列表中序列3所示的氨基酸序列組成的蛋白質；（f)由序列表中序列5所示的氨基 酸序列組成的蛋白質。
[0009] 本發(fā)明還保護所述Endostatin突變體與聚乙二醇的交聯(lián)物。
[0010] 本發(fā)明還保護含有所述Endostatin突變體的蛋白質與聚乙二醇的交聯(lián)物。
[0011] 所述交聯(lián)物的制備方法如下：所述Endostatin突變體(或含有所述Endostatin突 變體的蛋白質）與單甲氧基聚乙二醇丙醛反應，得到交聯(lián)物。
[0012] 所述交聯(lián)物的制備方法具體如下：取蛋白濃度為2mg/ml的所述Endostatin突變 體(或含有所述Endostatin突變體的蛋白質)的溶液，加入單甲氧基聚乙二醇丙醒并使其濃 度為l〇g/L，加入NaHBCN并使其濃度為20mM，室溫放置4小時，得到含有交聯(lián)物的溶液。
[0013] 本發(fā)明還保護所述Endostatin突變體、含有所述Endostatin突變體的蛋白質、或 所述交聯(lián)物在制備抑制和/或阻斷新生血管的生成的藥物中的應用。
[0014] 本發(fā)明還保護一種抑制和/或阻斷新生血管的生成的藥物，其活性成分為所述 Endostatin突變體、含有所述Endostatin突變體的蛋白質、或所述交聯(lián)物。
[0015] 所述新生血管具體可為視網膜新生血管和/或脈絡膜新生血管。
[0016] 本發(fā)明還保護所述Endostatin突變體、含有所述Endostatin突變體的蛋白質、或 所述交聯(lián)物在制備抑制內皮細胞遷移的藥物中的應用。
[0017] 本發(fā)明還保護一種抑制內皮細胞遷移的藥物，其活性成分為所述Endostatin突 變體、含有所述Endostatin突變體的蛋白質、或所述交聯(lián)物。
[0018] 所述內皮細胞具體可為HMEC細胞。
[0019] 以上任一所述的單甲氧基聚乙二醇丙醛的參數具體如下：分子量為2萬，分散度 < L 05〇
[0020] Endostatin是一種人體本身具有的內源性血管抑制劑，其全身給藥型腫瘤治療藥 物恩度已在市場上廣泛應用，安全性明顯優(yōu)于外源性血管抑制劑藥物貝閥單抗。本發(fā)明構 建了 Endostatin N末端Histidine突變體，試驗中發(fā)現(xiàn)Histidine N末端突變體鋅離子結 合明顯下降，但其穩(wěn)定性沒有明顯變化，且活性有提高。另外，突變后，其N末端失去了肽 酶D的作用位點，有助于提高N末端PEG或是其他物質修飾的穩(wěn)定性。因 N端突變造成了 Endostatin酶切位點的改變，在突變的Endostatin N末端進行PEG修飾，其穩(wěn)定性增強。 修飾產物在眼部球內注射后的半衰期為15天，可實現(xiàn)每月或是每2-3月給藥一次，更利于 眼科球部注射的治療。
【附圖說明】
[0021] 圖1為M-ES溶液的SDS-PAGE圖譜。
[0022] 圖2為穩(wěn)定性實驗中的SDS-PAGE圖譜。
[0023] 圖3為對肽酶D的穩(wěn)定性實驗中的HPLC圖譜。
[0024] 圖4為氧誘導視網膜病變動物模型中的照片。
[0025] 圖5為氧誘導視網膜病變動物模型中的抑制率。
[0026] 圖6為脈絡膜新生血管小鼠動物模型中的照片。
[0027] 圖7為脈絡膜新生血管小鼠動物模型中的抑制率。
[0028] 圖8為藥代曲線。
【具體實施方式】
[0029] 以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平 均值。
[0030] HMEC細胞：行知生物科技有限公司，貨號為AA-CELL-91。載體pET-30a(+):北京艾 比根生物。大腸桿菌DH5a :北京艾比根生物。C57BL/6J小鼠：北京維通利華實驗動物技術 有限公司，SCXK (京）2012-0001。單甲氧基聚乙二醇丙醛(分子量為2萬，分散度<1.05): 北京凱正生物工程發(fā)展有限責任公司。NaHBCN :sigma，156159。Calcein-AM :Calbiochem， 206700。肽酶 D :拜迪森生物，BD00101。環(huán)糊精：sigma，C4767。甘氨酸：sigma，410225。
[0031] 將Calcein-AM溶于DMS0,得到濃度為lmg/ml儲液，-20°C保存。取肽酶D，用15mM HAc水溶液溶解，得到肽酶D溶液。
[0032] 本發(fā)明的發(fā)明人根據大量實驗和驗證，發(fā)現(xiàn)將W-ES蛋白自N末端第1位氨基酸殘 基和第3位氨基酸殘基突變?yōu)槠渌被釟埢?，然后再與聚乙二醇交聯(lián)，得到的偶聯(lián)物的 穩(wěn)定性和活性均顯著增加。W-ES蛋白如序列表的序列1自N末端第2-184位氨基酸殘基 所示，其編碼基因如序列表的序列2自5'末端第4-552所示。M-ES蛋白如序列表的序列3 自N末端第2-184位氨基酸殘基所示，其編碼基因如序列表的序列4自5'末端第4-552所 示。M-ES蛋白是將W-ES蛋白自N末端第1位氨基酸殘基和第3位氨基酸殘基突變均由H 突變?yōu)镈得到的蛋白質。
[0033] 實施例1、M-ES蛋白和W-ES蛋白的制備
[0034] 一、M-ES 蛋白和 PEG-M-ES 的制備
[0035] 1、合成序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子并插入載體pET_30a(+)的NdeI和 EcoRI酶切位點，得到重組質粒。
[0036] 2、將步驟1得到的重組質粒導入大腸桿菌DH5 α，得到重組菌。
[0037] 3、將步驟1得到的重組菌接種至LB液體培養(yǎng)基，37 °C、230rpm振蕩培養(yǎng)至 OD6qq=O. 5-0. 8,加入IPTG并使其濃度為0. 5mM，然后37 °C、230rpm振蕩培養(yǎng)4h，然后 8000rpm離心5min并收集菌體，用含150mM NaCl的Tris-HCl緩沖液（pH9. 0、50mM)懸浮菌 體（5ml溶液/g濕菌體)并進行超聲破碎(功率200W，每超聲3秒停3秒，總時間為20min)， 然后12000