rpm離心10min,取沉淀(包涵體)。
[0038] 4、取步驟3得到的沉淀，按照lg: IOmL的比例加入溶解液(溶劑為水，含6M鹽酸 胍、50mM Tris-HCl、20mM DTT，pH9. 0)，室溫靜置 10h，然后 12000rpm離心 20min，取上清液。
[0039] 5、取步驟4得到的上清液，裝入透析袋中，在透析液(溶劑為水，含5mM Tris-HCl、 2mM GSSG、0. 2mM GSH，30mM 環(huán)糊精，IOmM 甘氨酸，pH7. 5)中 4°C透析 8 小時，然后 12000rpm 離心20min，取上清液。
[0040] 6、取100毫升步驟5得到的上清液，進(jìn)行陰離子交換層析。
[0041] 采用HiTrapQHP型陰離子交換層析柱，柱子長度為5cm，內(nèi)徑為I. 6cm，采用的流動 相為50毫升Tris-HCl緩沖液（pH8. 5、50mM)，收集全部的穿透液。
[0042] 7、取步驟6得到的穿透液，采用超濾濃縮管(蛋白截留分子量為3KD)進(jìn)行濃縮，得 到蛋白濃度為2mg/ml的濃縮液，即為M-ES溶液。
[0043] M-ES溶液的SDS-PAGE圖譜見圖1的泳道1，Marker的分子量順序（自下至上）： 14. 4、18. 4、25、35、45、66. 2、116. OKDa?；厥漳繕?biāo)帶并測序，測序結(jié)果表明，N端前10個氨 基酸殘基如序列表的序列3自N端第1至10個氨基酸殘基所示。
[0044] 8、取步驟7得到的M-ES溶液，加入單甲氧基聚乙二醇丙醛并使其濃度為10g/L，加 入NaHBCN (-種還原劑，使修飾反應(yīng)形成的雙鍵還原為單鍵后更穩(wěn)定)并使其濃度為20mM， 室溫放置4小時，采用陽離子柱層析，收集IOOmM NaCl洗脫組分，得到PEG-M-ES溶液。
[0045] 二、W-ES 蛋白和 PEG-W-ES 的制備
[0046] 用序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子代替序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子， 其它同步驟一。得到W-ES溶液和PEG-W-ES溶液。
[0047] 實(shí)施例2、性能比較
[0048] 一、鋅離子結(jié)合實(shí)驗(yàn)
[0049] 將實(shí)施例1制備的M-ES溶液用Tris-HCl緩沖液（pH7. 4、5mM)稀釋至蛋白濃度為 1 μ M，得到M-ES待測液。在M-ES待測液中加入EDTA和ZnCl2 (使EDTA和ZnCl2的濃度均 為100 μ Μ)，室溫靜置10小時，然后用Tris-HCl緩沖液（pH7. 4、5mM)充分透析，然后用原子 吸收光譜儀檢測鋅離子含量。
[0050] 將實(shí)施例1制備的W-ES溶液用Tris-HCl緩沖液（pH7. 4、5mM)稀釋至蛋白濃度為 1 μ M，得到W-ES待測液。在W-ES待測液中加入EDTA和ZnCl2 (使EDTA和ZnCl2的濃度均 為100 μ Μ)，室溫靜置10小時，然后用Tris-HCl緩沖液（pH7. 4、5mM)充分透析，然后用原子 吸收光譜儀檢測鋅離子濃度。
[0051] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0052] 結(jié)果見表1。結(jié)果表明，與W-ES蛋白相比，M-ES蛋白結(jié)合鋅離子的能力大大降低。
[0053] 表1鋅離子含量檢測結(jié)果
[0054]
[0055] 二、穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0056] 取實(shí)施例1制備的PEG-M-ES溶液，用Tris-HCl緩沖液（pH8. 0、10mM)作為溶劑制 備蛋白濃度為lmg/ml的PEG-M-ES待測液，過濾除菌后分裝于滅菌的西林瓶中。將過濾除 菌后的PEG-M-ES待測液37 °C靜置，分別于0時刻、7天后和15天后取樣，進(jìn)行SDS-PAGE。
[0057] 取實(shí)施例1制備的PEG-W-ES溶液，用Tris-HCl緩沖液（pH8. (KlOmM)作為溶劑制 備蛋白濃度為lmg/ml的PEG-W-ES待測液，過濾除菌后分裝于滅菌的西林瓶中。將過濾除 菌后的PEG-W-ES待測液37 °C靜置，分別于0時刻、7天后和15天后取樣，進(jìn)行SDS-PAGE。
[0058] 采用上海天能公司Tanon-2500 (R)儀器自帶軟件掃描目標(biāo)帶和降解帶的信號，降 解率=降解帶的信號/(降解帶的信號+目標(biāo)帶的信號）X 100%。
[0059] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。單次實(shí)驗(yàn)的SDS-PAGE圖譜見圖2。
[0060] 結(jié)果見表2。結(jié)果表明，PEG-M-ES的PEG降解率顯著低于PEG-W-ES的PEG降解 率，即M-ES蛋白的N端更穩(wěn)定。
[0061] 表2降解率的結(jié)果（％)
[0062]
[0063] 三、對肽酶D的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)
[0064] 取實(shí)施例1制備的M-ES溶液，用Tris-HCl緩沖液（pH8. OUOmM)作為溶劑制備濃 度為2mg/ml的M-ES待測液。將3ml M-ES待測液與3ml50 μ g/ml的肽酶D溶液混勻，室 溫孵育，分別于 1〇111；[11、20111；[11、30111；[11、60111；[11、90111；[11、120111；[11、150111；[11和180111；[11后取樣。向 500 μ 1取樣得到的樣品加入50 μ 1冰醋酸終止反應(yīng)，然后取50 μ 1，通過HPLC法檢測酶切 率。
[0065] 取實(shí)施例1制備的W-ES溶液，用Tris-HCl緩沖液（pH8. OUOmM)作為溶劑制備濃 度為2mg/ml的W-ES待測液。將3ml W-ES待測液與3ml50 μ g/ml的肽酶D溶液混勻，室 溫孵育，分別于 1〇111；[11、20111；[11、30111；[11、60111；[11、90111；[11、120111；[11、150111；[11和180111；[11后取樣。向 500 μ 1取樣得到的樣品加入50 μ 1冰醋酸終止反應(yīng)，然后取50 μ 1，通過HPLC法檢測酶切 率。
[0066] 色譜柱為納微科技的 UniSil5-120C18(4. 6X250mm),貨號 QCS131109。溶液 A : 0. 1%TFA水溶液；溶液B :0. 1%TFA乙腈溶液。液相色譜條件：流動相為溶液A和溶液B的混 合液，流速為1.0 ml/min ;在25分鐘內(nèi)流動相由15%溶液B (85%溶液A，體積比）線性上升 至75%溶液B (25%溶液A，體積比）；檢測器波長為280nm ;柱溫為25°C。本段中的％均代 表體積比。酶切率等于代表酶切后片段的峰的峰面積除以全部峰的峰面積。
[0067] 某個樣本的譜圖見圖3。
[0068] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0069] 結(jié)果見表3。結(jié)果表明，與W-ES蛋白相比，M-ES蛋白對肽酶D的穩(wěn)定性更好。
[0070] 表3酶切率檢測結(jié)果（％)
[0071]
[0072] 四、對雞胚絨毛尿囊膜（CAM)血管生成的抑制實(shí)驗(yàn)
[0073] 分別取實(shí)施例1制備的M-ES溶液、PEG-M-ES溶液或W-ES溶液，用生理鹽水調(diào)整 至所需濃度。
[0074] 將雞蛋種蛋放入孵化箱（37°C ±0. 5°C)，氣室向上，每天轉(zhuǎn)動2-3次。第7天，在透 射燈下觀察并確定CAM，用牙科鉆在氣室頂端開l-2mm小孔。在胚頭前l(fā)cm、兩條卵黃靜脈之 間的卵殼投影部分，用鉛筆勾畫出1.5cmX2cm區(qū)域，用碘酒及酒精消毒后用砂輪在蛋殼表 面劃刻出Imm凹痕，滴少量生理鹽水于凹痕內(nèi)。將無菌的直徑為6mm的微孔濾膜放在CAM的 血管最少處，在微孔濾膜中央加入15 μ 1待測溶液(待測溶液分別為：5 μ g/ml的PEG-M-ES 溶液、20 μ g/ml 的 PEG-M-ES 溶液、40 μ g/ml 的 PEG-M-ES 溶液、5 μ g/ml 的 M-ES 蛋白溶液、 20 μ g/ml的M-ES蛋白溶液、40 μ g/ml的M-ES蛋白溶液、20 μ g/ml的W-ES蛋白溶液和生 理鹽水)，然后用封口膠封閉窗口，繼續(xù)培養(yǎng)3天。滴入10%福爾馬林固定20min，以濾膜為 中心剪下約3. 5cmX3. 5cm的尿囊膜，平鋪于平皿中展開，晾干，置于顯微鏡下觀察，記錄以 濾膜為中心、直徑5mm范圍內(nèi)的血管數(shù)目（Blood vessel number, BVN)。計(jì)算血管抑制率 (Inhibition rate, IR)〇
[0075] 血管抑制率=(生理鹽水組的血管數(shù)-實(shí)驗(yàn)組的血管數(shù)）+生理鹽水組的血管 數(shù) X100%。
[0076] 進(jìn)行五次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。
[0077] 結(jié)果見表4。結(jié)果表明，與W-ES蛋白相比，M-ES蛋白的血管抑制率更高，PEG-M-ES 的血管抑制率相對于M-ES蛋白進(jìn)一步提高。
[0078] 表4血管數(shù)和血管抑制率的結(jié)果
[0079]

[0080] 注：*與生理鹽水組比較P < 0. 01，#與W-ES組比較P < 0. 01。
[0081] 五、對HMEC遷移抑制實(shí)驗(yàn)
[0082] 分別取實(shí)施例1制備的M-ES溶液、PEG-M-ES溶液或W-ES溶液，用生理鹽水調(diào)整至 所需濃度。待測溶液分別為1 μ g/ml的PEG-M-ES溶液、16 μ g/ml的PEG-M-ES溶液、160 μ g/ ml的PEG-M-ES溶液、1 μ g/ml的M-ES蛋白溶液、16 μ g/ml的M-ES蛋白溶液、160 μ g/ml的 M-ES蛋白溶液、16 μ g/ml的W-ES蛋白溶液和生理鹽水，各個溶液采用的溶劑均為生理鹽 水。
[0083] 1、取第一個24孔板，每孔加入80 μ 1待測溶液和920 μ 1含0. 5%FBS、100 μ g/ml 青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液。
[0084] 2、取HMEC細(xì)胞，用0. 25%胰蛋白酶-EDTA37°C消化1分鐘，取細(xì)胞，用100 μ g/ml 青霉素和100 μ g/ml鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液重懸，得到8 X IO5個細(xì)胞/ml的細(xì)胞懸液。
[0085] 3、取第二個24孔板，其上放置24孔Transwell小室（8 μ m孔徑，Millipore),每 個小室加入184 μ 1步驟2得到的細(xì)胞懸液和16 μ 1待測溶液，37°C孵育1小時。
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