胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一類胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物的多肽。
[0002] 本發(fā)明還涉及上述新的胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物的治療用途。
【背景技術(shù)】
[0003] 糖尿病（Diabetes mellitus，DM)是以胰島素相對或絕對不足為特征的代謝性疾 病，胰島素相對或絕對不足引發(fā)高血糖，進(jìn)而導(dǎo)致三大營養(yǎng)物質(zhì)代謝紊亂，最終影響患者正 常生理功能并且引起并發(fā)癥。全球糖尿病患者與日俱增，在20-79歲的成人中，糖尿病患者 人數(shù)在2013年已達(dá)3. 82億，預(yù)計(jì)2030年將達(dá)到4. 39億。其中，中國是世界第一糖尿病大 國，當(dāng)前我國約有I. 1億，而且還在快速增長。肥胖癥的增多導(dǎo)致糖尿病的增多，約90%的 患II型糖尿病的人群可劃歸為肥胖。全世界有2億4千6百萬人患有糖尿病，預(yù)計(jì)到2025 年將會有3億8千萬人患糖尿病。許多人還有其他心血管風(fēng)險(xiǎn)因素，包括高/異常LDL及 甘油三脂和低HDL。糖尿病目前不能根治，患者只能終生依賴藥物。傳統(tǒng)抗糖尿病藥物各有 缺點(diǎn)，迫切需要研發(fā)新型抗糖尿病藥物。
[0004] 肽類藥物較小分子化學(xué)藥物和大分子蛋白藥物具有自身的優(yōu)點(diǎn)如下：首先，它們 多數(shù)源于內(nèi)源性肽或其他天然肽，結(jié)構(gòu)清楚，作用機(jī)制明確；其次，它們與一般小分子藥物 相比，活性更高、用藥劑量更小、毒副作用更低，而且代謝終產(chǎn)物為氨基酸（無毒副作用）； 第三，它們與外源蛋白質(zhì)相比，免疫原性較低，而且可以化學(xué)合成，產(chǎn)品純度高，質(zhì)量可控； 第四，多肽藥物往往能規(guī)避胃腸道消化，克服蛋白質(zhì)分子被消化酶破壞從而不能口服的弊 端。
[0005] 胰高血糖素樣肽（Glueagon-like peptide-1，GLP-1)屬于腸促胰島 素（Incretin)家族，是一種主要由小腸粘膜L細(xì)胞分泌的多肽，有兩種活性形式： GLP-1-(7-37)和GLP-1-(7-36)_酰胺。GLP-I通過與特異性受體胰高血糖素樣肽1受 體（GLPlR)結(jié)合而發(fā)揮抗糖尿病作用，主要生理功能有：改善胰島β細(xì)胞功能，促進(jìn) 胰島素分泌，降低餐后血糖而維持血糖穩(wěn)態(tài)，加強(qiáng)胰島素生物合成，抑制胰高血糖素 分泌，抑制胃腸蠕動尤其是胃排空從而增加飽足感、降低食欲并控制體重。與傳統(tǒng)抗 糖尿病藥物相比，GLP-I的優(yōu)點(diǎn)在于維持血糖穩(wěn)態(tài)和有效控制體重（Cardiovascular effects of glucagonlike peptide-lagonists，Am J Cardiol.2011 ； 108:33B-41B. Cardiovascular effects of the DPP-4inhibitors,Diab Vase Dis Res.2012 ； 9:109-16.Incretin mimetics as a novel therapeutic option for hepatic steatosis，Liver Int. 2006 ;26:1015-7.) ^ GLP-I 半衰期極短，分泌后很快被二肽基肽 酶-IV(Dipeptidyl-peptidase-IV，DPP_IV)或中性肽鏈內(nèi)切酶（Neutral endopeptidase， NEP) 24. 11降解。所以不能直接將GLP-I用于臨床，而是需要研發(fā)抗酶解的GLP-I受體激動 劑。
[0006] 然而，臨床試驗(yàn)證明GLP-I受體激動劑的缺點(diǎn)也很明顯，主要有以下幾個(gè)方面： 首先，半衰期較短導(dǎo)致注射頻率密集，給病人帶來不便；其次，藥動學(xué)及安全性均不明確， 引入的外源化學(xué)基團(tuán)宄竟如何代謝、如何排泄、對人體有何影響，均不明確，尚待進(jìn)一步 研宄。最新臨床前研宄表明，均衡的胰高血糖素樣肽1受體和胰高血糖素受體（GLP-1R/ GCGR)雙靶點(diǎn)激動劑表現(xiàn)出了相對于單純GLP-IR激動劑更有效、更安全的治療老鼠肥胖的 作用，同時(shí)在血糖控制上也有所改進(jìn)（A new glucagon and GLP-lco-agonist eliminates obesity in rodents, Nat Chem Biol. 2009;5:749-57·)。與此相關(guān)的是關(guān)于胃泌酸調(diào)節(jié) 素（Oxyntomodulin, 0XM)的研宄，OXM是腸上皮L-細(xì)胞分泌的一種短肽激素，由37個(gè)氨基 酸組成，是胰高血糖素的內(nèi)源性前體物。OXM是均衡的GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動劑，其對膜 高血糖素受體的效力比對GLP-I受體的效力低2倍，并且比天然膜高血糖素和GLP-I對它 們各自受體的效力低。盡管天然的OXM生物活性較低，臨床研宄表明持續(xù)四周皮下注射天 然OXM仍然能夠顯著減輕病患的體重，減少攝食。（Subcutaneous oxyntomodulin reduces body weight in overweight and obese subjects:a double-blind, randomized, control led trial, Diabetes. 2005 ;54:2390-5.)OXM具有很短的半衰期，可被細(xì)胞表面的二肽基肽 酶IV(DPP-IV)迅速失活，體內(nèi)穩(wěn)定性差。
[0007] GLP-1R/GCGR共激動劑已證實(shí)可明顯減少高脂飲食誘導(dǎo)肥胖大鼠 （DIO rat)體 重和脂肪量，超過了任何一種單純的GLP-IR激動劑，并在血糖控制上也有所改善。這些 變化與減少食物攝入和大量增加能量消耗有關(guān)。另有報(bào)道指出：具有蛋白酶抗性的長效 GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動劑，與具有相同效力的長效GLP-IR激動劑相比，可顯著減輕體重、 降低甘油三酯和抗高血糖。除此以外，長效GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動劑可改善代謝指標(biāo)， 例如血衆(zhòng)膜島素、瘦素和脂聯(lián)素 （Unimolecular dual incretins maximize metabolic benefits in rodents, monkeys, and humans, Sci Transl Med. 2013 ;5:209.)〇
[0008] 綜上所述，研發(fā)GLP-1R/GCGR雙靶點(diǎn)激動劑是目前研制治療糖尿病的多肽藥物的 主要方向。近年來，研宄人員通過化學(xué)修飾開發(fā)出了幾種潛在的一天注射一次以及一周注 射一次的OXM類似物。其中應(yīng)用最為廣泛的修飾劑是單甲氧基聚乙稀二醇（methoxypoly ethylene glycol，mPEG)，通過增加 OXM的分子排阻體積，降低藥物分子的腎臟過濾清 除率，從而延長mPEG修飾后的藥物血漿半衰期，以實(shí)現(xiàn)每周注射的目標(biāo)。盡管這種方法 能夠顯著提高多肽藥物的半衰期，但大部分蛋白的生物活性也有不同程度降低。更危 險(xiǎn)的是，mPEG是一種人體不能代謝的分子，用其衍生的多肽蛋白類藥物可導(dǎo)致腎臟的空 泡化(Short communication:renal tubular vacuolation in animals treated with polyethylene-glycol-conjugated proteins,Toxicol Sci. 1998 ；42:152-7 ；Safety assessment on polyethylene glycols (PEGs) and their derivatives as used in cosmetic products. Toxicology, 2005 ;214:1-38.)。絕大多數(shù)經(jīng) mPEG 修飾的藥物分子被 用于腫瘤治療，因此PEG的毒性往往被極大限度的忽視。從化學(xué)的本質(zhì)出發(fā)，只有通過優(yōu) 化多肽序列，才能從根本上解決多肽藥物的生化和生理特性，這也是生物化學(xué)家公認(rèn)的事 實(shí)。并在此基礎(chǔ)上，通過生物學(xué)手段進(jìn)一步提高多肽藥物的各種活性和穩(wěn)定性指標(biāo)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明的目的在于提供一種胃泌酸調(diào)節(jié)素（Oxyntomodulin, 0ΧΜ)類似物。發(fā)明人 經(jīng)過大量的實(shí)驗(yàn)研宄，對胃泌酸調(diào)節(jié)素分子進(jìn)行了改造，結(jié)果表明該類胃泌酸調(diào)節(jié)素類似 物具有更長的半衰期，具有促胰島素活性，沒有不良反應(yīng)發(fā)生，用于糖尿病等疾病的治療。
[0010] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供上述胃泌酸調(diào)節(jié)素類似的治療用途，新的胃泌酸調(diào) 節(jié)素類似物潛在地可作為新一代治療糖尿病的藥物，或用于降糖，或用于降低體重。
[0011] 本發(fā)明是基于胃泌酸調(diào)節(jié)素（OXM)、胰高血糖素樣肽（GLP-I)、艾塞那肽 (Exenatide)及胰高血糖素（Glucagon)的母體肽而改進(jìn)的。胃泌酸調(diào)節(jié)素（OXM)的母體肽 如下（SEQ ID NO. 25):
[0012] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg -Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Lys-Arg-Asn-Lys-Asn-Asn-I Ie-Ala-OH
[0013] 胰高血糖素樣肽（GLP-I)的序列如下（SEQ ID NO. 26):
[0014] His-Ala-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Val-Ser-Ser-Tyr-Leu-Glu-Gly-Gln-A Ia-Ala-Lys-Glu-Phe-Ile-Ala-Trp-Leu-Val-Lys-Gly-Arg-Gly-OH
[0015] 艾塞那肽（Exenatide)的序列如下（SEQ ID NO. 27):
[0016] His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu -Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-P r〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0017] 胰高血糖素（Glucagon)的序列如下（SEQ ID NO. 28):
[0018] His-Ser-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-Arg-A rg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-〇H
[0019] 本發(fā)明的第一個(gè)方面是提供一種胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物，該胃泌酸調(diào)節(jié)素類似物含 有以下氨基酸序列表示的母體肽：
[0020] His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xa al6-Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20 -Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp -Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-X aa30_Xaa31_Xaa32_Xaa33_Xaa34 _Xaa35_Xaa36_Xaa37_Xaa38 _Xaa39_Xaa40_C0R1
[0021] 其中，R1= -〇H 或-NH2;
[0022] Xaa2 = Aib，Ser 或 D-Ser ;
[0023] XaalO = Lys 或 Tyr ;
[0024] Xaal3 = Lys 或 Tyr ;
[0025] Xaal6 = Ser，Aib，Lys 或 Glu ;
[0026] Xaal7 = Lys 或 Arg ;
[0027] Xaal8 = Arg 或 Ala ;
[0028] Xaa20 = His，Gln 或 Lys ;
[0029] Xaa21 = Asp 或 Glu ;
[0030] Xaa23 = lie，Leu 或 Val ;
[0031] Xaa24 = Glu 或 Gln ;
[0032] Xaa27 = Met，Leu 或不存在；
[0033] Xaa28 = Ser，Asn，Asp，Arg 或不存在；
[0034] Xaa29 = Ala，Gly，Thr 或不存在；
[0035] Xaa30 = Gly 或不存在；
[0036] Xaa31 = Gly 或不存在；
[0037] Xaa32 = Pro 或不存在；
[0038] Xaa33 = Ser 或不存在；
[0039] Xaa34 = Ser 或不存在；
[0040] Xaa35 = Gly 或不存在；
[0041] Xaa36 = Ala 或不存在；
[0042] Xaa37 = Pro 或不存在；
[0043] Xaa38 = Pro 或不存在；
[0044] Xaa39 = Pro 或不存在；
[0045] Xaa40 = Ser 或不存在；
[0046] 所述氨基酸序列中，XaalO, Xaal6, Xaal7或Xaa20中至少一個(gè)為Lys，所述至少一 個(gè)Lys或所述序列的第12位Lys的側(cè)鏈與親脂性的取代基相連，連接方式為所述親脂性的 取代基以其羧基與一個(gè)橋接基團(tuán)的氨基形成酰胺鍵，橋接基團(tuán)的氨基酸殘基的羧基與母體 肽的Lys的N-末端殘基上形成一個(gè)酰胺鍵連接到母體肽上；
[0047] 所述橋接基團(tuán)為Glu，Asp和/或（PEG)m，其中m為2-10的整數(shù)；所述親脂性取代 基為選自CH3(CH2)nCO-或HOOC(CH2) nCO-的一個(gè)?；?，其中η是10-24的整數(shù)。
[0048] 優(yōu)選的橋接基團(tuán)可以為Glu-(PEG)m或ASp-(PEG),或（PEG) m，連接方式如下：
[0049]
[0050] 本發(fā)明優(yōu)選的化合物是含有下述氨基酸序列的母體肽：
[0051] His-Xaa2-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaa10-Ser-Lys-Xaal3-Leu-Asp-Xa al6-Xaal7-Xaal8-Ala-Xaa20 -Xaa21-Phe-Xaa23-Xaa24-Trp -Leu-Xaa27-Xaa28-Xaa29-X aa30_Xaa31_Xaa32_Xaa33_Xaa34 _Xaa35_Xaa36_Xaa37_Xaa38 _Xaa39_Xaa40_C0R1
[0052] 其中，R1=-NH2;
[0053] Xaa2 = Aib 或 D-Ser ;
[0054] XaalO = Lys 或 Tyr ;
[0055] Xaal3 = Lys 或 Tyr ;
[0056] Xaal6 = Ser，Aib，Glu 或 Lys ;
[0057] Xaal7 = Lys 或 Arg ;
[0058] Xaal8 = Arg