-Phe-Thr (t_Bu)-Ser ( tBu)-Asp (OtBu)-Tyr (t-Bu)-Ser (t-Bu)-Lys (Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp (OtBu)-Ser(Ot Bu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2-OH)-Ala-Ala-His (Boc)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Glu(OtBu) -Trp(Bo c)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala_rink amide 樹脂D 呢啶 /N，N-二甲基甲酰胺溶液脫除 Fmoc 基 團(tuán)，然后按照常規(guī)條件依次偶連Fmoc-Glu-OtBu，tBu單保護(hù)的十八碳脂肪酸得：
[0174] Boc-His(Boc)-D-Ser(t_Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr (t_Bu)-Phe-Thr (t_Bu)-Ser ( tBu)-Asp (OtBu)-Tyr (t-Bu)-Ser (t-Bu)-Lys (Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp (OtBu)-Ser(Ot Bu) -Lys (Fmoc-PEG2-PEG2-Glu-CO (CH2) 16C02tBu) -Ala-Ala-His (Boc) -Asp (OtBu) -Phe-Val- Glu (OtBu)-Trp (Boc)-Leu-Leu-Arg (pbf)-Ala-rink amide 樹脂。
[0175] lc)多肽全保護(hù)的脫除：
[0176] 將
[0177] Boc-His(Boc)-D-Ser(t_Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr (t_Bu)-Phe-Thr (t_Bu)-Ser ( tBu)-Asp (OtBu)-Tyr (t-Bu)-Ser (t-Bu)-Lys (Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp (OtBu)-Ser(Ot Bu) -Lys (Fmoc-PEG2-PEG2-Glu-CO (CH2) 16C02tBu) -Ala-Ala-His ?oc) -Asp (OtBu) -Phe-Val- Glu(OtBu)-Trp(Boc)-Leu-Leu-Arg(pbf)-Ala_rink amide 樹脂加入至圓底燒瓶中，冰浴 下，加入切割液TFA/EDT/Phen〇l/H20(88/2/5/5,體積比），升溫，控制裂解液溫度25°C，反 應(yīng)120分鐘。過(guò)濾，濾餅用少量三氟乙酸洗滌3次，合并濾液。濾液在攪拌下緩慢倒入冰乙 醚中。靜置1.0小時(shí)以上，待沉淀完全。傾去上清液，沉淀離心，用冰乙醚洗滌6次，得到 粗品化合物：
[0178] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Tyr-Ser-Lys-Tyr-Leu-Asp-Ser-L ys (PEG2-PEG 2-G1u-C0 (CH2) 16C02H) -Ala-Ala-His-Asp-Phe-Val-Glu-Trp-Leu-Leu-Arg-Al a~NH2 〇
[0179] Id)多肽化合物的精制純化：
[0180] 將Ic中所得粗品溶于5.0%乙酸在乙腈：H20 = 1:1 (體積比）的溶液中，通過(guò) 5. Om反相C18的填充的50mm X 250mm柱上進(jìn)行2次半制備型HPLC而純化。用30-60%乙 腈-0. 1 %三氟乙酸/H2O梯度以40mL/min將該柱洗脫45. 0分鐘，收集含有肽的組分，濃縮 除去乙腈后凍干。得到HPLC純度大于95%的純品。用液質(zhì)聯(lián)用分析分離出的產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)質(zhì) 子化分子離子峰的m/z值為：4116. 0，理論值為4116. 6。
[0181] 2.多肽化合物5的合成：
[0182] 結(jié)構(gòu)序列：
[0183] His-(D-Ser)-Gln-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Lys(PEG 2-PEG2-CO(CH2)14CH3)-Ser -Lys-Tyr-Leu-Asp-Aib-Arg-Arg-Ala-Gln-Asp-Phe-Val-Gln-Trp-Leu-Met-Asn-Thr-Gly- Gly-Pr〇-Ser-Ser-Gly-Ala-Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser-NH2
[0184] 2a)主肽鏈組裝：
[0185] 按照Fmoc/t-Bu策略在CS336X多肽合成儀（美國(guó)CS Bio公司）上合成0· 25毫 摩爾規(guī)模的如下多肽：
[0186] Boc-His (Boc) -D-Ser (t~Bu) -Gln (OtBu) -Gly-Thr (t-Bu) -Phe-Thr (t-Bu) -Ser (tB u)-Asp (OtBu)-Lys (ivDde)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t~Bu)-Leu-Asp (OtBu)-Aib-Arg(Pb f)-Arg (Pbf)-Ala-Gln (Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt) -Thr (t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser (t-Bu)-Ser (t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser (t-Bu)-rink amide樹脂
[0187] (I)第一步：將 0· 75 克 Rink amide MBHA-LL 樹脂（Novabiochem，loading 0· 34 毫摩爾/g)在二氯甲烷（DCM)中溶脹一個(gè)小時(shí)，用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)充分洗滌樹脂 三次；
[0188] (2)第二步：以Rink amide樹脂為載體，以偶聯(lián)劑由6-氯苯并三氮 唑-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯（HCTU)，有機(jī)堿N，N-二異丙基乙胺（DIEPA)兩者按物 質(zhì)的量比1:1，以N，N-二甲基甲酰胺（DMF)為溶劑，進(jìn)行程序反應(yīng)，依次進(jìn)行縮合反應(yīng)連接 Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Pro-OH(3x), Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-〇H(2 x), Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Gly-OH(2x), Fmoc-Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Met-OH ，F(xiàn)moc-Leu-OH, Fmoc-Trp(Boc)-OH, Fmoc-Glu(OtBu)-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc- Asp (OtBu)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH(2x), Fmoc-Aib-OH, Fm oc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Tyr(t-Bu)-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu) -OH, Fmoc-Lys(ivDde)-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Ser(t-Bu)-OH, Fmoc-Thr (t-Bu)-OH ,Fmoc-Phe-OH, Thr(t-Bu)-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-D-Ser(t-Bu)-OH, Bo c_His (Boc) -OH 得到：Boc-His (Boc) -D-Ser (t_Bu) -Gln (OtBu) -Gly-Thr (t_Bu) -Phe-Thr (t -Bu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Lys(ivDde)-Ser(t_Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t_Bu)-Leu-Asp(OtBu) -Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-M et-Asn(Trt) -Thr(t_Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t_Bu)-Ser(t_Bu)-Gly-Ala_Pr〇-Pr〇-Pr〇-Se r (t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲燒（DCM)，甲醇 (Methanol)，二氯甲烷（DCM)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF)充分洗滌樹脂各三次。
[0189] 需要說(shuō)明的是：1)其中第一個(gè)氨基酸Fmoc-Ser (t-Bu)-OH的投料量與樹脂用量的 物質(zhì)的量比為1:1~6:1 ;2)接下來(lái)的每次縮合反應(yīng)中Fmoc保護(hù)氨基酸，6-氯苯并三氮 唑-1，1，3, 3-四甲基脲六氟磷酸酯（HCTU)，有機(jī)堿N，N-二異丙基乙胺（DIEPA)的用量均 過(guò)量2~8倍，反應(yīng)時(shí)間為1~5個(gè)小時(shí)。
[0190] 2b) 1-(4,4_二甲基-2,6-二氧代亞環(huán)己基）-3-甲基-丁基（ivDde)的脫除與親 脂取代基的引入：
[0191] 用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)/二氯甲烷（DCM) = 1:1(體積比）的溶液中將樹脂 洗滌兩次，加入新鮮制備的3.0%的肼水合物N，N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液，將該反應(yīng)混 合物在室溫下振搖10~30分鐘，然后過(guò)濾。將肼處理步驟重復(fù)5次得：
[0192] Boc-His (Boc) -D-Ser (t~Bu) -Gln (OtBu) -Gly-Thr (t-Bu) -Phe-Thr (t-Bu) -Ser (tB u)-Asp (OtBu)-Lys-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t~Bu)-Leu-Asp (OtBu)-Aib-Arg(Pbf)-Arg( Pbf)-Ala-Gln (Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t- Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t_Bu)-Ser(t_Bu)-Gly-Ala_Pr〇-Pr〇-Pr〇-Ser(t_Bu)-rink amide 樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲烷（DCM)，甲醇（Methanol)，二氯甲烷 (DCM)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF)充分洗滌樹脂各三次。
[0193] 加入 FmocNH-PEG2-OH(Quanta BioDesign), 2-(7-偶氮苯并三氮 唑）-N，N，N'，N'_四甲基脲六氟磷酸酯（HATU)，二異丙基乙基胺（DIEPA)的N，N-二甲基甲 酰胺（DMF)混合偶聯(lián)液（均過(guò)量5倍），振搖2小時(shí)后，過(guò)濾。此后依次用N，N-二甲基甲 酰胺（DMF)，二氯甲烷（DCM)，甲醇（Methanol)，二氯甲烷（DCM)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF) 充分洗滌樹脂各三次得：
[0194] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser (tBu) -Asp (OtBu) -Lys (Fmoc-PEG2) -Ser (t-Bu) -Lys (Boc) -Tyr (t-Bu) -Leu-Asp (OtBu)- Aib-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln (Trt)-Trp(Boc)-Leu- Met-Asn (Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro- Ser (t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲烷（DCM)，甲 醇（Methanol)，二氯甲烷（DCM)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF)充分洗滌樹脂各三次。
[0195] 20%的哌啶（Piperidine)/N, N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液脫除Fmoc基團(tuán)（30分 鐘，重復(fù)脫除兩次），加 Fmoc-PEG2-OH, 2-(7-偶氮苯并三氮唑）-N，N，Ν'，Ν' -四甲基脲六氟 磷酸酯（HATU)，二異丙基乙基胺（DIEPA)的N，N-二甲基甲酰胺（DMF)混合偶聯(lián)液（均過(guò) 量 5 倍），偶連反應(yīng)得到：Boc_His (Boc) -D-Ser (t_Bu) -Gln (OtBu) -Gly-Thr (t_Bu) -Phe-Th r(t-Bu)-Ser(tBu)-Asp (OtBu)-Lys(Fmoc-PEG2-PEG2)-Ser (t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Le u-Asp (OtBu)-Aib-Arg (Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp (Boc)-Leu-Met-Asn(Trt)-Thr(t-Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t-Bu)-Ser(t-Bu)-Gly-Ala-Pro- Pr〇-Pr〇-Ser(t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲燒 (DCM)，甲醇（Methanol)，二氯甲烷（DCM)，N，N-二甲基甲酰胺（DMF)充分洗滌樹脂各三次。
[0196] 20%的哌啶（Piperidine)/N, N-二甲基甲酰胺（DMF)溶液脫除Fmoc基團(tuán)（30分 鐘，重復(fù)脫除兩次），加十六酸（棕櫚酸），2- (7-偶氮苯并三氮唑）-N，Ν，Ν'，Ν' -四甲基脲六 氟磷酸酯（HATU)，二異丙基乙基胺（DIEPA)的N，N-二甲基甲酰胺（DMF)混合偶聯(lián)液（均 過(guò)量5倍），偶連反應(yīng)得到：
[0197] Boc-His(Boc)-D-Ser(t-Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu)-Ser( tBu) -Asp (OtBu) -Lys(PEG2-PEG2-C16)-Ser(t-Bu)-Lys(Boc)-Tyr(t-Bu)-Leu-Asp(OtBu )-Aib-Arg (Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Gln(Trt)-Asp (OtBu)-Phe-Val-Gln(Trt)-Trp(Boc)-L eu-Met-Asn (Trt)-Thr (t_Bu)-Gly-Gly-Pro-Ser(t_Bu)-Ser(t_Bu)-Gly-Ala-Pro-Pro- Pro-Ser (t-Bu)-rink amide樹脂。此后依次用N，N-二甲基甲酰胺（DMF)，二氯甲烷（DCM)， 甲醇（Methanol)，二氯甲烷（DCM)充分洗滌樹脂各三次后，真空抽干。
[0198] 2c)多肽全保護(hù)的脫除：
[0199] 將
[0200] Boc-His (Boc)-D-Ser(t~Bu)-Gln(OtBu)-Gly-Thr(t-Bu)-Phe-Thr(t-Bu) -Se r(tBu)-Asp (OtBu)-Lys(PEG2-PEG2-C16)-Ser (t-Bu)-Lys (Boc)-Tyr (t-Bu)-Leu-A