一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于克隆技術領域，尤其涉及一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法。
【背景技術】
[0002]抵抗素是新發(fā)現(xiàn)的一種脂肪組織特異性分泌的脂肪細胞因子，具有抵抗胰島素的作用，認為是肥胖與II型糖尿病之間未曾被發(fā)現(xiàn)的聯(lián)系紐帶，甚至認為肥胖能引起胰島素抵抗就是因為脂肪細胞分泌了抵抗素的緣故。抵抗素的發(fā)現(xiàn)是糖尿病研宄中的一大進展，已成為連接肥胖與II型糖尿病相關性的研宄熱點。但是近幾年的研宄結(jié)果對抵抗素參與機體胰島素抵抗的生物學功能的闡述發(fā)生了分歧，在對人類II型糖尿病群體的統(tǒng)計分析中甚至出現(xiàn)了沒有相關性的結(jié)果，大部分科學研宄者推測這很可能是實驗動物的物種不同造成的原因，同時近期在人類中發(fā)現(xiàn)了有抵抗素剪接體的存在，目前我們的研宄團隊也發(fā)現(xiàn)非人靈長類恒河猴也有抵抗素剪接體的存在，而且恒河猴抵抗素剪接體的剪接位點和片段大小與人類的完全一致，或許這是在部分人類II型糖尿病群體中抵抗素生物學功能研宄結(jié)果出現(xiàn)不同結(jié)果的原因所在。因為非人靈長類恒河猴在遺傳和生理生化上都與人類存在較高的相似性，因此克隆恒河猴抵抗素剪接體基因是研宄人類抵抗素剪接體基因比較醫(yī)學功能的理想選擇。另外，慢病毒載體能有效介導外源基因在細胞或機體組織內(nèi)穩(wěn)定表達，可長期持續(xù)性表達目的蛋白，是目前將外源基因?qū)爰毎麅?nèi)穩(wěn)定表達的較好的工具。所以，構建恒河猴抵抗素剪接體的重組慢病毒載體，對人類抵抗素剪接體的生物學功能的研宄，具有重要的比較醫(yī)學意義。
[0003]剪接體的克隆方法，通常情況用PCR+1的方法對目的基因的等位基因進行隨機克隆篩選，通過對大量單克隆菌的測序和篩選，分析等位基因，篩選出剪接體。一般情況，對慢病毒載體的構建過程中包裝慢病毒顆粒采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑進行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，并用含丙酮酸鈉的病毒包裝培養(yǎng)基進行包裝顆粒。
[0004]用一般的方法進行慢病毒包裝，存在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、慢病毒滴度不高等不足，尤其是滴度不高一直是困擾慢病毒載體運用的一大問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法，旨在解決用PCR+1方法篩選工作量大、費用高昂，傳統(tǒng)的方法進行慢病毒包裝，存在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率低、慢病毒滴度不高的問題。
[0006]本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法包括:
[0007]步驟一、運用普通PCR直接同時擴增抵抗素全長和剪接體基因，用膠回收方法直接回收剪接體條帶，然后進行載體的快速克隆測序；
[0008]步驟二、使用慢病毒載體高效轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染所有慢病毒載體質(zhì)粒，并使用滅活血清包裝慢病毒顆粒，并獲得高滴度的重組慢病毒原液；
[0009]進一步，攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法具體包括:
[0010]步驟一、設計恒河猴抵抗素ORF擴增引物，分別攜帶PLV-EFla-EGFP [2A]Puro質(zhì)粒的酶切位點 EcoR I 和 BamH I，h游引物 5’ -GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’ (EcoR I )，下游引物 5’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’ (BamH I )；
[0011]步驟二、恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增，包括RNA提取、cDNA合成、恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增；
[0012]步驟三、恒河猴抵抗素剪接體慢病毒載體的構建，將純化后測序正確的246bp大小的PCR產(chǎn)物和PLV-EFla-EGFP[2A]Puro質(zhì)粒分別進行酶切，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物16°C過夜連接，將連接產(chǎn)物培養(yǎng)過夜，次日挑取培養(yǎng)板上的單克隆菌至5mL AMP+LB培養(yǎng)液試管中，37°C搖菌過夜；
[0013]步驟四、提取重組質(zhì)粒；
[0014]步驟五、將酶切鑒定和測序正確的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP[2A]Puro重組質(zhì)粒、PHl和PH2包裝質(zhì)粒在Stbl 3感受態(tài)細胞中轉(zhuǎn)化擴增，提取質(zhì)粒，并用微量分光光度計測定各質(zhì)粒濃度；
[0015]步驟六、轉(zhuǎn)染前2d將293T細胞接種到1cm圓碟中，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞單層長至70%即可開始轉(zhuǎn)染慢病毒系統(tǒng)質(zhì)粒。
[0016]進一步，轉(zhuǎn)染慢病毒系統(tǒng)質(zhì)粒的具體方法為:
[0017]先將5 μ g的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP [2A] Puro重組質(zhì)粒加入500 μ LOpt1-MEM中，再加入3.75 μ g的HPl質(zhì)粒和1.25 μ g的PH2質(zhì)粒，輕輕混勻，靜置5min ;在另一只管中將20 μ L的EndoFectin Lenti慢病毒高效轉(zhuǎn)染試劑加入480 μ L Opt1-MEM中混勻；再將稀釋轉(zhuǎn)染試劑的后一只管中的混合液緩慢加入前一管中輕輕混勻，并在室溫靜置孵育20min。然后把293T包裝細胞的培養(yǎng)基小心更換為1mL慢病毒包裝培養(yǎng)液，再將ImL轉(zhuǎn)染混合液均勻加入293T細胞培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)8h后更換為1mL新鮮的慢病毒包裝培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)染48h后在熒光顯微鏡下觀察eGFP載體報告基因的轉(zhuǎn)染效率，并收獲重組病毒原液。
[0018]本發(fā)明可免去PCR+1方法篩選大量的工作和高額的費用，消除獲得剪接體基因的概率限制，并高效、快速、廉價地直接獲得剪接體基因；可高效轉(zhuǎn)染慢病毒載體質(zhì)粒，并獲得高滴度的重組慢病毒滴度。
【附圖說明】
[0019]圖1是本發(fā)明實施例提供的恒河猴抵抗素剪接體PCR擴增電泳圖；
[0020]圖2是本發(fā)明實施例提供的恒河猴抵抗素ORF和剪接體序列比對結(jié)果；
[0021]圖3是本發(fā)明實施例提供的恒河猴抵抗素剪接體重組慢病載體質(zhì)粒的雙酶切鑒定結(jié)果；
[0022]圖4是本發(fā)明實施例提供的感染恒河猴抵抗素剪接體重組慢病毒的KMB17細胞cDNA的RT-PCR檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0023]為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0024]下面結(jié)合附圖及具體實施例對本發(fā)明的應用原理作進一步描述。
[0025]1、試驗材料和試劑
[0026]質(zhì)粒、菌株及細胞:
[0027]PLV-EFla-EGFP [2A] Puro/PHl/PH2慢病毒系統(tǒng)購于英茂盛業(yè)公司，感受態(tài)DH5 α (中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研宄所保存)，感受態(tài)Stbl3購于GeneCopoeia公司，293T細胞和KMB17細胞(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研宄所保存)。
[0028]主要試劑:
[0029]TRIzol Reagent 購于美國 invitroger 公司，PCR master mix、內(nèi)切酶 EcoR I 和BamH 1、T4連接酶均購于TAKARA公司，膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購于Omega公司，DMEM和FBS購于康寧公司，Opt 1-MEM購于GIBCO公司，Polybrene購于Sigma公司，轉(zhuǎn)染試劑EndoFectin-Lenti和cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于GeneCopoeia公司。
[0030]2、引物設計與合成
[0031]根據(jù)NCBI JF740676.1報道序列設計恒河猴抵抗素ORF擴增引物，分別攜帶PLV-EFla-EGFP [2A]Puro 質(zhì)粒的酶切位點 EcoR I 和 BamH I，h游引物 5’-GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’(EcoR I )，下游引物 5 ’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’ (BamH I )。并送由上海生工合成引物。
[0032]3、恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增
[0033]3.1RNA 提取
[0034]在正常飼養(yǎng)恒河猴群中隨機采集4只恒河猴的后肢靜脈抗凝血，分別取200 μ L放入1.5mL的無RNA酶離心管，加入800 μ L的TRIzol Reagent溶液，漩渦振蕩充分混勻；再加入200 μ L的三氯甲烷，漩渦振蕩15s，室溫放置2-15min，12000rpm 4°C 15min ;將上清移到另一個新的無RNA酶的1.5mL離心管中，加等體積的異丙醇，混勻后室溫靜置10_15min，12000rpm 4°C 15min，棄上清；然后加入lmL75%乙醇，漩禍振蕩，8000rpm 4°C 5min ;棄上清，空氣瞭干 5min，加入 35-50 μ L RNase-free ddH20，55-60°C水浴溶解 1min
[0035]3.2cDNA 合成
[0036]根據(jù)cDNA合成試劑盒說明書，在PCR管中加入RNA 4 μ L、Oligo (dT) 18 primerI μ L、Random primer I μ L、ddH20 6 μ L，65°C熱水浴5min，立即放回冰上。然后依次加人 5XReact1n Buffer 4 μ L、Ribolock RNase Inhibit1n I μ L、1mM dNTP Mix 2 μ L、Revert Aid M-MuLV Reverse Transcriptase I μ L、ddH20 5 μ L，進行第二步逆轉(zhuǎn)錄反應，條件為 25 °C 5min、42°C 60min、7(TC 5min。
[0037]3.3恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增
[0038]PCR擴增反應體系:2XPCR Master Mix 12.5 μ L、恒河猴全血cDNA 2yL、上游引物 I μ L、下游引物 IyL, ddH20 8.5 μ L，總體積為 2