5 μ L。反應條件:94°C 3min、93°C 30s、56.4°C 50s,72°C 50s、35 個循環(huán)，72°C 7min。
[0039]用2%的瓊脂糖凝膠電泳，可獲得324bp和246bp大小的兩個擴增條帶(見圖1)，用膠回收試劑盒分別對324bp和246bp的條帶進行純化，并取樣送由上海生工測序，測序結果表明324bp擴增產物為恒河猴抵抗素ORF全長序列，246bp擴增產物為恒河猴被剪接78bp的抵抗素剪接體，比對結果見圖2。
[0040]4、恒河猴抵抗素剪接體慢病毒載體的構建
[0041]4.1酶切、連接和轉化
[0042]4.1.1將純化后測序正確的246bp大小的PCR產物和PLV-EFla-EGFP [2A] Puro質粒分別進行酶切，PCR產物酶切體系和條件為:PCR產物12 yL、10XK Buffer 2 μ L、EcoRI I μ L、BamH I I μ UddH2O 4 μ L，總體積為201 μ L，37°C酶切2h ;質粒酶切體系和條件:PLV-EFla-EGFP [2A] Puro 質粒 5 μ L、10 X K Buffer 2 μ L、EcoR I lyL、BamH I I μ L、ddH20 11 yL，總體積為201 yL，37°C酶切2h ;然后用2%的瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切產物。
[0043]4.1.2將以上的酶切產物16°C過夜連接，體系為:PCR酶切產物15 μ L、質粒酶切產物 I yL、10XT4DNA Ligase Buffer 2.51yL、T4 DNA Ligase IyUddH2O 5.5yL，總體積25 μ L0
[0044]4.1.3將以上的連接產物12 μ L加入DH5 α感受態(tài)細胞，冰浴45min、42°C 90s、冰浴3min、加入LB培養(yǎng)液800 μ L混勻，37°C培養(yǎng)Ih ;取200 μ L混合液到AMP+培養(yǎng)板涂板，37°C培養(yǎng)過夜；次日挑取培養(yǎng)板上的單克隆菌至5mL AMP+LB培養(yǎng)液試管中，37°C搖菌過夜。
[0045]4.2重組質粒的提取
[0046]根據(jù)小量質粒提取試劑盒說明書抽提質粒，先將5mL菌液分批移至1.5mL離心管中1000g離心Imin,棄上清用250 μ L的Selut1n I重懸沉定，加入250 μ L的Selut1nII顛倒混勻至透明液體，再加入300 yL的Selut1n III顛倒混勻至出現(xiàn)白色絮狀物，13000g離心lOmin，取上清至制備管中的柱子中，1000g離心lmin，加入500 μ L HB Buffer1000g離心lmin，然后加入Wash buffer700 μ L 1000g離心lmin，重復洗滌一次，再用13000g 離心 2min，最后加入 40 μ L Elut1n buffer 室溫放置 lmin, 13000g 離心 lmin，可重復溶解一次，既獲得重組質粒。然后進行EcoR I和BamH雙酶切鑒定(見圖3)，再將酶切正確的質粒送往上海生工測序鑒定。
[0047]4.3重組慢病毒顆粒的包裝和鑒定
[0048]4.3.1將酶切鑒定和測序正確的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP [2A] Puro重組質粒、PHl和PH2包裝質粒用以上4.1.3的方法在Stbl3感受態(tài)細胞中轉化擴增，用以上4.2方法分別提取質粒，并用微量分光光度計測定各質粒濃度。
[0049]4.3.2轉染前2d將293T細胞接種到1cm圓碟中，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基(10%FBS、1%雙抗)在37°C 5% C02中培養(yǎng)，待細胞單層長至70 %即可開始轉染慢病毒系統(tǒng)質粒。先將5 μ g的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP[2A]Puro重組質粒加入500 μ LOpt1-MEM中，再加入3.75 μ g的HPl質粒和1.25 μ g的PH2質粒，輕輕混勻，靜置5min ;在另一只管中將20 μ L的EndoFectin Lenti慢病毒高效轉染試劑加入480 μ L Opt1-MEM中混勻；再將稀釋轉染試劑的后一只管中的混合液緩慢加入前一管中輕輕混勻，并在室溫靜置孵育20min。然后把293T包裝細胞的培養(yǎng)基小心更換為1mL慢病毒包裝培養(yǎng)液(高糖DMEM 94%、5%滅活FBS、1%雙抗)，再將ImL轉染混合液均勻加入293T細胞培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)8h后更換為1mL新鮮的慢病毒包裝培養(yǎng)液，在轉染48h后在熒光顯微鏡下觀察eGFP載體報告基因的轉染效率，并收獲重組病毒原液。
[0050]4.3.3恒河猴抵抗素剪接體重組慢病毒鑒定
[0051]將KMB17細胞傳至6孔板，次日把培養(yǎng)液換為含5 μ g/mL Polybrene的5%滅活FBS、1%雙抗的高糖DMEM，加入每孔100 μ L的慢病毒原液感染細胞，8h后更換為5%滅活FBS、I %雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)至72h，即可在熒光顯微鏡下觀察KMB17細胞中載體報告基因eGFP的表達情況，可觀察到較強的綠色熒光說明重組慢病毒已經有效感染靶細胞，并介導報告基因和目的基因在靶細胞中表達。分別提取細胞的總RNA并逆轉錄為cDNA用RT-PCR進行擴增，通過電泳得到了 246bp大小的恒河猴抵抗素剪接體目的條帶(見圖4)，說明在KMB17細胞中有抵抗素剪接體基因mRNA的表達。證明已經成功構建了恒河猴抵抗素剪接體的慢病毒表達載體，并可有效介導恒河猴抵抗素剪接體在靶細胞中高效表達。
[0052]本發(fā)明可免去PCR+1方法篩選大量的工作和高額的費用，消除獲得剪接體基因的概率限制，并高效、快速、廉價地直接獲得剪接體基因；可高效轉染慢病毒載體質粒，并獲得高滴度的重組慢病毒滴度。
[0053]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內。
【主權項】
1.一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法，其特征在于，所述的攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法包括: 步驟一、運用普通PCR直接同時擴增抵抗素全長和剪接體基因，用膠回收方法直接回收剪接體條帶，然后進行載體的快速克隆測序； 步驟二、使用慢病毒載體高效轉染試劑轉染所有慢病毒載體質粒，并使用滅活血清包裝慢病毒顆粒，并獲得高滴度的重組慢病毒原液。2.如權利要求1所述的攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法，其特征在于，攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法具體包括: 步驟一、設計恒河猴抵抗素ORF擴增引物，分別攜帶PLV-EFla-EGFP[2A]Puro質粒的酶切位點 EcoR I 和 BamH T，h游引物 5’ -GGAATTCCACCATGAAAGCCCTCTGTCTCCTCCT-3’ (EcoR I )，下游引物 5’ -CGGGATCCCGTCAGGGCTGCAGACGACAGCAGC-3’ (BamH I )； 步驟二、恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增，包括RNA提取、cDNA合成、恒河猴抵抗素剪接體的PCR擴增； 步驟三、恒河猴抵抗素剪接體慢病毒載體的構建，將純化后測序正確的246bp大小的PCR產物和PLV-EFla-EGFP[2A]Puro質粒分別進行酶切，用2%的瓊脂糖凝膠電泳，分別回收酶切產物，將酶切產物16 °C過夜連接，將連接產物培養(yǎng)過夜，次日挑取培養(yǎng)板上的單克隆菌至5mL AMP+LB培養(yǎng)液試管中，37 °C搖菌過夜； 步驟四、提取重組質粒； 步驟五、將酶切鑒定和測序正確的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP[2A]Puro重組質粒、PHl和PH2包裝質粒在Stbl3感受態(tài)細胞中轉化擴增，提取質粒，并用微量分光光度計測定各質粒濃度； 步驟六、轉染前2d將293T細胞接種到1cm圓碟中，用高糖DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，待細胞單層長至70%即可開始轉染慢病毒系統(tǒng)質粒。3.如權利要求1所述的攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法，其特征在于，轉染慢病毒系統(tǒng)質粒的具體方法為: 先將5 μ g的恒河猴抵抗素剪接體PLV-EFla-EGFP [2A] Puro重組質粒加入500 μ LOpt1-MEM中，再加入3.75 μ g的HPl質粒和1.25 μ g的PH2質粒，輕輕混勻，靜置5min ； 在另一只管中將20 μ L的EndoFectin Lenti慢病毒高效轉染試劑加入480 μ LOpt1-MEM中混勻；再將稀釋轉染試劑的后一只管中的混合液緩慢加入前一管中輕輕混勻，并在室溫靜置孵育20min ； 然后把293T包裝細胞的培養(yǎng)基小心更換為1mL慢病毒包裝培養(yǎng)液，再將ImL轉染混合液均勻加入293T細胞培養(yǎng)液中，37°C培養(yǎng)8h后更換為1mL新鮮的慢病毒包裝培養(yǎng)液，在轉染48h后在熒光顯微鏡下觀察eGFP載體報告基因的轉染效率，并收獲重組病毒原液。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種攜帶恒河猴抵抗素剪接體基因慢病毒載體的構建方法，運用普通PCR直接同時擴增抵抗素全長和剪接體基因，用膠回收方法直接回收剪接體條帶，然后進行載體的快速克隆測序；使用慢病毒載體高效轉染試劑轉染所有慢病毒載體質粒，并使用滅活血清包裝慢病毒顆粒，并獲得高滴度的重組慢病毒原液。本發(fā)明可免去PCR+1方法篩選大量的工作和高額的費用，消除獲得剪接體基因的概率限制，并高效、快速、廉價地直接獲得剪接體基因；可高效轉染慢病毒載體質粒，并獲得高滴度的重組慢病毒滴度。
【IPC分類】C12N15/66, C12N15/867, C12N15/65
【公開號】CN104928320
【申請?zhí)枴緾N201510387359
【發(fā)明人】魯帥堯, 馬開利, 乞素冬, 李鴻鈞, 和占龍, 馬進, 陳瑜, 吳正存
【申請人】中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月3日