引物組、試劑盒及其在hpv全基因組檢測中的用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及病毒檢測領(lǐng)域，具體的，本發(fā)明涉及一組引物、該組引物在HPV基因組 的擴(kuò)增和/或HPV的檢測中的用途、一種試劑盒、該試劑盒在HPV基因組擴(kuò)增、HPV分型和/ 或HPV檢測中的用途，以及一種獲得HPV全基因組序列的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 宮頸癌是世界上第三大常見女性腫瘤，并且86%病例發(fā)生在發(fā)展中國家[Arbyn MjCastellsague X, de Sanjose S, Bruni L, Saraiya M, Bray F, FerlayJ:Worldwide burden of cervical cancer in 2008. Ann 0ncol2011, 22:2675 - 2686·]。據(jù)世界范圍內(nèi)統(tǒng)計，每年 大約有46萬左右新發(fā)病例，有超過20萬的婦女死于宮頸癌，世界每年發(fā)病的75-80%在發(fā) 展中國家，中國由于人口眾多，每年新發(fā)病例超過13萬之多，占到世界發(fā)病的25%，且近年 來處于增長趨勢，在廣大農(nóng)村地區(qū)增高趨勢更加明顯，并呈現(xiàn)發(fā)病年齡提前的現(xiàn)象[開麗 比努?依馬木，馬彩玲.宮頸癌的診斷治療進(jìn)展[J].地方病通報，2006, 21 (6) :62-65.]。
[0003] 1977年ZurHause首先提出人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV)是宮頸癌 致病因素的假設(shè)；1992年，世界衛(wèi)生組織（WHO)宣布人乳頭瘤病毒是引起宮頸癌變的首要 因素；1995年，國際癌癥研宄署（IARC)專題討論會將HPV感染確定為宮頸癌的主要病因， 明確宮頸癌是一種感染性疾病。HPV感染是宮頸癌發(fā)生的主要因素。
[0004] 人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科（Papovaviridae)A亞群內(nèi)的一組DNA病毒，無包 膜，相對分子質(zhì)量為5X106?；蚪M呈雙鏈閉環(huán)狀，含有7900對堿基。人乳頭狀瘤病毒是 一個全球范圍來，廣泛傳播的DNA病毒，主要感染人的粘膜及皮膚。研宄表示99. 7%的宮頸 癌組織中可以檢測到HPV病毒。
[0005] HPV雙鏈環(huán)狀基因組DNA，主要包括四個部分，早期區(qū)域，晚期區(qū)域，上游調(diào)控區(qū) 和在E5及L2之間極短的高突變率的非編碼區(qū)。乳頭狀瘤病毒進(jìn)化速度緩慢，以每年 2±0. 5X KT8個堿基突變頻率進(jìn)行。同時進(jìn)化過程也呈現(xiàn)出組織及宿主特異性，導(dǎo)致HPV 基因組多態(tài)性在進(jìn)化過程中，只隨機(jī)發(fā)生在各型別少數(shù)病毒亞型內(nèi)[Bernard H U，Burk R D, Chen Z, et al. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189PV types and proposal of taxonomic amendments (J) · Virology, 2010, 401(I):70-79. ]〇
[0006] 現(xiàn)有研宄表明，HPV致病分子機(jī)制是病毒基因組DNA的復(fù)制和表達(dá)，其中 早期基因區(qū)El、E2、E4、E5、E6和E7轉(zhuǎn)錄是HPV在宿主細(xì)胞增殖的關(guān)鍵步驟[IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans[M]. World Health Organization，2007.]，目前對于HPV與宮頸癌發(fā)生的研宄僅局限在高危型HPV型別之間， 很少探討亞型致癌性的不同。
[0007] HPV檢測廣泛用于HPV相關(guān)惡性病變的自然史和病因?qū)W研宄。傳統(tǒng)方法主要是 通過形態(tài)學(xué)和免疫學(xué)對其進(jìn)行檢測。前者包括巴氏涂片細(xì)胞學(xué)檢測、陰道鏡檢查、宮頸活 檢組織病理學(xué)檢查、電鏡技術(shù)（直接觀察病毒顆粒）、宮頸攝像檢查以及宮頸熒光檢查等。 后者包括應(yīng)用免疫組化法通過抗LI蛋白與外殼蛋白反應(yīng)檢測HPV、采用放射免疫沉淀法 測定宮頸上皮細(xì)胞內(nèi)瘤變（CIN)和宮頸癌患者血清中的HPV16抗體水平、用血清免疫吸附 試驗(yàn)（ELISA)檢測血清中的HPV E6、E7特異性抗體蛋白等[Sehr P，Zumbach K，Pawlita M. A generic capture ELISAfor recombinant proteins fused to glutathione S-transferase: validation for HPV serology[J].Journal of immunological methods，2001，253 (I) : 153-162.]。傳統(tǒng)方法的特異性和靈敏度不夠理想，存在較高的假陰 性率和假陽性率，且不便于對HPV進(jìn)行分型，因而目前HPV的主要實(shí)驗(yàn)或診斷技術(shù)是應(yīng)用分 子生物學(xué)方法進(jìn)行HPV-DNA檢測。
[0008] 目前所使用的HPV-DNA檢測方法主要是使用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)目前常用類型包括： 通用引物PCR、型特異PCRCType-Specific PCR)和實(shí)時熒光定量PCR。但這些方法都只基 于不同亞型的某部分基因組區(qū)域（多數(shù)為100-500bp左右）進(jìn)行分型檢測。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一或者至少提出一種商業(yè)手 段。
[0010] 依據(jù)本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供一組引物，該組引物能夠特異性的結(jié)合不同 型別的HPV，該組引物包含選自SEQ ID NO :1-28的14對引物中的至少2對，所稱14對引 物的序列分別如 SEQ ID NO :1 和 2、SEQ ID NO :3 和 4、SEQ ID NO :5 和 6、SEQ ID NO :7 和 8、SEQ ID NO :9 和 10、SEQ ID NO :11 和 12、SEQ ID NO :13 和 14、SEQ ID NO :15 和 16、SEQ ID NO :17 和 18、SEQ ID NO :19 和 20、SEQ ID NO :21 和 22、SEQ ID NO :23 和 24、SEQ ID NO :25和26以及SEQ ID NO :27和28所示。在本發(fā)明的一些實(shí)施例中，該引物組包含選自 SEQ ID NO :1-28的14對引物中的至少3對、至少4對、至少5對、至少5對、至少7對、至少 8對、至少9對、至少10對、至少11對、至少12對、至少13對引物或者全部14對引物。在 本發(fā)明的一個實(shí)施例中，該組引物還包括序列如SEQ ID NO :29和30所示的一對引物。該 組引物是發(fā)明人經(jīng)過大量序列設(shè)計和大量試驗(yàn)篩選組合，確定下來的能夠分別特異性的識 別不同型別的HPV的引物，并且，該組引物能夠在同一反應(yīng)體系下互不干擾的特異性結(jié)合 到各自的目標(biāo)模板上，在同一反應(yīng)體系中特異性擴(kuò)增出多個型別的HPV全基因組序列。 [0011] 依據(jù)本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供一種前述任一實(shí)施例中的一組引物在HPV基 因組的擴(kuò)增和/或HPV的檢測中的用途。利用前述本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的這組 引物，能夠?qū)?HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59和/或HPV66進(jìn)行全基因擴(kuò)增及全基因分型。既能快速對HPV病毒進(jìn)行檢測，同時也 能對其基因組各種特性進(jìn)行分析。
[0012] 依據(jù)本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，其包含前述任一實(shí)施例中的一 組引物。該該試劑盒包含的引物是發(fā)明人經(jīng)過大量序列設(shè)計和大量試驗(yàn)篩選組合，確定下 來的能夠分別特異性的識別不同型別的HPV的引物，并且，該引物能夠在同一反應(yīng)體系下 互不干擾的特異性結(jié)合到各自的目標(biāo)模板上，在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增出多個型別的HPV全 基因組序列。
[0013] 依據(jù)本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供一種前述試劑盒在HPV基因組擴(kuò)增、HPV分型 和/或HPV檢測中的用途。利用前述本發(fā)明這一方面的試劑盒，利用其所包含的引物，能夠 對 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59 和/或HPV66進(jìn)行全基因擴(kuò)增及全基因分型。既能快速對HPV病毒進(jìn)行檢測，同時也能對 其基因組各種特性進(jìn)行分析。
[0014] 基于一種能夠?qū)PV病毒全基因組信息的檢測方法將會更加有利于進(jìn)行HPV病毒 的鑒定及分型檢測，有助于對型間變異體的檢測，有助于對于宮頸癌患者病情發(fā)展的預(yù)期， 有助于更好的輔助指導(dǎo)臨床策略。而且，HPV病毒基因組技術(shù)，也能夠給HPV疫苗的研制、 HPV感染的防治提供更多有效的意見，并且隨著對HPV病毒基因組了解的深入，HPV全基因 組技術(shù)可能有助于提供給患者個性化的醫(yī)療意見。本發(fā)明針對目前缺乏一種能對HPV病毒 全基因組進(jìn)行檢測方法，提供一種檢測HPV全基因組的方法。
[0015] 檢測HPV全基因組，需要獲得HPV全基因組序列，依據(jù)本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明 提供一種獲得HPV全基因組序列的方法，該方法包括以下步驟：從待測樣品中獲得核酸；利 用上述本發(fā)明一方面或者任一實(shí)施例中的一組引物擴(kuò)增所述核酸，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；對擴(kuò)增 產(chǎn)物進(jìn)行序列測定，獲得測序數(shù)據(jù)，測序數(shù)據(jù)包括多個讀段；基于測序數(shù)據(jù)，獲得HPV全基 因組序列。所說的測序數(shù)據(jù)可以通過對核酸序列進(jìn)行測序文庫制備、上機(jī)測序獲得，在本發(fā) 明的一個實(shí)施例中，獲取所述測序數(shù)據(jù)，包括：制備所述核酸的測序文庫，對所述測序文庫 進(jìn)行測序。測序文庫的制備方法根據(jù)所選擇的測序方法的要求進(jìn)行，測序方法依據(jù)測序平 臺的不同可選擇但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500測序平臺、Life Technologies 公司的Ion Torrent平臺和單分子測序平臺，測序方式可以選擇單端測序，也可以選擇雙末 端測序，獲得的下機(jī)數(shù)據(jù)是測讀出來的片段，稱為讀段（reads)。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中， 在獲得擴(kuò)增產(chǎn)物之后，包括：電泳檢測所述擴(kuò)增產(chǎn)物，依據(jù)所得的電泳檢測結(jié)果進(jìn)行HPV分 型，具體的，可以先利用通用引物例如利用SEQ ID NO :29和30,對獲得的核酸進(jìn)行第一擴(kuò) 增，電泳檢測第一擴(kuò)增是否有產(chǎn)物，即看電泳圖譜上是否有擴(kuò)增產(chǎn)物條帶，若有條帶說明該 樣品核酸中有